Строма уплотнена что это значит: Диффузный фиброаденоматоз молочных желёз | СПб ГБУЗ «Городская поликлиника №122»

Диффузный фиброаденоматоз молочных желёз | СПб ГБУЗ «Городская поликлиника №122»



Диффузный фиброаденоматоз молочных желёз | СПб ГБУЗ «Городская поликлиника №122»

6

Фев

2016

Диффузный фиброаденоматоз молочных желёз (ФАМ) – это доброкачественное заболевание  молочной железы, которое может захватывать как одну, так и обе груди.

Основополагающей причиной развития фиброаденоматоза считается дисбаланс гормональной системы в организме. Как правило, изменения в гормональном фоне женщины происходит в следующих случаях:

стрессовые ситуации – психическая нестабильность, психоэмоциональные срывы. Особенно, если человек находится в стрессовом состоянии постоянно или длительное время;

гинекологические заболевания, сопровождающиеся расстройством функциональной способности яичников, спровоцированные воспалительными процессами репродуктивных органов, нарушениями менструального цикла;

аборты, в том числе и медикаментозные.

отказ или раннее прекращение грудного вскармливания малыша – провоцирует застой в молочных железах. Грудное вскармливание  следует практиковать как минимум в течение года после рождения ребенка;

сексуальные проблемы – практика прерванного полового акта, нерегулярный секс или отсутствие постоянного полового партнера, неудовлетворение сексуальных потребностей;

патологии щитовидной железы – недостаток или избыток гормонов щитовидной железы  влияет и на баланс половых гормонов;

вредные привычки (курение, употребление алкоголя).

Фиброаденоматоз может протекать в различных формах:

диффузный

локализованный

очаговый

кистозный

фиброзный

узловой

 Форму заболевания определяет врач-маммолог, онколог.

Симптомами заболевания могут быть:

часто повторяющиеся колющие боли в молочной железе;

нагрубание и уплотнение молочных желез за несколько дней до начала менструации или вне зависимости от цикла;

ощущение давления и жгучей боли в молочной железе;

выделения из молочных протоков, как самостоятельные, так и появляющиеся при сдавливании соска;

увеличение лимфатических узлов в подмышечной области (иногда).

Болезненность имеет свойство усиливаться после нервного или физического перенапряжения.

Обнаружив у себя хоть один из выше перечисленных признаков, стоит незамедлительно обратиться к врачу-маммологу или онкологу !

Для того чтобы заметить изменения ткани молочной железы, необходимо проводить ежемесячное обследование!

Выполнить его может каждая женщина самостоятельно. Для этого необходимо внимательно ощупать грудь по всей окружности, а потом более внимательно – в каждом квадранте.

В настоящее время широкое распространение получили рентгенологический (цифровая маммография) и  ультразвуковой методы исследования.

Ультразвуковое исследование более предпочтительно для молодых женщин.

Уважаемые пациентки, обращаем Ваше внимание, что в условиях нашей поликлиники оба метода активно выполняются на современном оборудовании.

 Женщинам старше 39 лет обязательно проходить маммографию, независимо от того, есть у них жалобы или нет.

Начиная с 39 до 50 лет, если нет жалоб, необходимо выполнять обследование 1 раз в 2 года, после 50 лет-1 раз в год.

Частота обследования, прежде всего, зависит от присутствия рисков, наследственности, а также при наличии каких-либо жалоб.

Кроме того, нужно избегать неблагоприятных факторов и переохлаждений, правильно питаться и носить удобное бельё.

Основные принципы терапии фиброаденоматоза

Для определения необходимой схемы терапевтических мероприятий важно установить и устранить причину патологии, а также сбалансировать работу гормональной системы.

Подбор лечения осуществляется в зависимости от возрастной категории пациента, стадии болезни, особенности метаболизма и гормонального фона, наличия каких-либо других смежных патологий в организме.

В настоящее время терапия данного заболевания предполагает назначение гормональных препаратов, гомеопатических средств, витаминов, антидепрессантов, адаптогенов. Для снятия болезненности могут быть назначены нестероидные противовоспалительные средства, однако это делается на непродолжительный период.

Метод обследования и схема лечения назначается врачом в индивидуальном порядке, учитывая особенности каждой женщины.

Хирургическое вмешательство требуется только если существует подозрение на рак.

С  целью сохранения женского здоровья рекомендуется ежегодно наблюдаться у гинеколога и маммолога!

Спасибо за отзыв!

Ваш отзыв был получен и отправлен администратору!

УЗИ Молочных желёз

Нормальная анатомия молочной железы женщины

Молочная железа состоит из стромы и паренхимы. Паренхиматозный компонент молочной железы представлен протоками а ацинусами молочных желез. Стромальный компонент является поддержкой молочной железы, т.е. ее соединительной тканью, которая связывает собственно паренхиму молочной железы с жировой тканью. Количество и распространенность структурных компонентов молочной железы строго индивидуально, зависит от возраста женщины и ее гормонального статуса.

Паренхиматозный компонент молочной железы состоит из 15-25 долей, которые имеют собственные протоки (млечные хода), впадающие в общее пространство под соском. Такое пространство называется «млечный синус». Каждый млечный проток последовательно разделяется на сегментарный, субсегментарный и терминальный. Терминальные протоки впадают в ацинус молочной железы.

Ткань молочной железы имеет три уровня. Первый, самый поверхностный, подкожный слой, состоит из жира, упорядоченного в дольки, ограниченного фиброзными перегородками связками Купера. Связки Купера соедияют поверхностный слой со средним. Средний слой собственно молочная железа, маммарный слой представлен паринхиматозным компонентом. Самый глубокий, ретромаммарный слой, производное жировых долек, спереди ограничен глубокой маммарной фасцией, позади грудной фасцией.

Особенности молочной железы, связанные с менструальным циклом

Грудь гормонально-чувствительный орган репродуктивный системы женщины. При нормальном овуляторном менструальном цикле изменения, происходящие в молочной железе, состоят в следующем. В первую, фолликулярную фазу цикла (7-14 дни) происходят минимальные структутрные изменения. Протоки желез переживают фазу пролиферации развития желез, альвеолы закрыты, клеточная строма плотная. В лютеиновую фазу цикла (16-20 дни) пролиферация желез заканчивается, происходит расширение желез, вызванное отеком и гиперемией альвеол. В норме при УЗИ молочной железы циклические изменения заметны слабо.

Особенности молочной железы, связанные с беременностью и кормлением грудью

При гормональных изменениях, связанных с беременностью и лактацией, происходит бурное развитие паренхимы, а именно протоков и ацинусов молочной железы. За счет этого грудь увеличивается в размерах, часто становится более чувствительной. Это сопровождается регрессом междольковой стромы, жировые дольки подкожной и ретромаммарной зоны уменьшаются. Только во время кормления грудью происходит полный цикл развития всех структур молочной железы, что имеет крайнюю важность в профилактике рака груди. Но в это время молочная железа особенно уязвима к внешним факторам. Поэтому, во время кормления грудью, особенно на этапах становления лактации, очень важно минимальное внешнее воздействие. Сцеживание должно по возможности проводиться самой кормящей мамой с помощью молокоотсоса. Расщеживание «чужими руками» с «крокодильими слезами» кормящей оказывает глубокую травматизацию груди, сводит на нет ценность грудного вскармливания в профилактике рака молочной железы, и даже наоборот, повышает риск развития рака груди в перспективе.

Особенности строения молочной железы в менопаузе

После прекращения циклических изменений в репродуктивной системе и при прогрессирующей гормональной депресси, паренхиматозный компонент молочной железы постепенно атрофируется, жировая ткань замещает железистую, грудь теряет свою эластичность и форму.

УЗИ молочных желез в норме

Самая поверхностная структура, различимая при УЗИ молочных желез, — кожа. Кожа при узи молочных желез выглядит как эхогенная равномерная зона, толщиной 2 мм, в области ареолы кожа незначительно толще. Фиброзно-кистозная болезнь (фиброзно-кистозная мастопатия)Жировые дольки в подкожной и ретромаммарной зонах при узи молочных желез выглядят низкоэхогенными структурами, пронизанные эхогенными линиями и пунктирными локусами. Жировые дольки имеют многогранную или элиптоидную форму. Ткань, представляющая маммарную зону, состоит из тесно связанных паринхиматозных структур и соединительной ткани. В общем, эта зона на УЗИ молочных желез является гиперэхогенной с небольшими участками гипоэхогенной жировой ткани. На узи молочных желез у лактирующих женщин маммарная зона среднеэхогенна стакими же включениями жира низкой эхогенности. Гипоэхогенные линейные ветвящиеся структуры при узи молочных желез на фоне гиперэхогенной маммарной зоны протоки. Ширина протоков в норме на узи молочных желез от 1 до 2 мм, они не имеют расширений, к периерии молочной железы могут равномерно суживаться. Исключением являются молочные синусы, которые расширяются непосредственно в позадисосковом регионе.

Ненормальная картина при УЗИ молочных желез наблюдается при наличии доброкачественных и злокачественных образований молочной железы.

Доброкачественные образования при УЗИ молочных желез

Доброкачественные образования молочной железы подразделются на кистозные и солидные.

Кисты молочночной железы бывают:

• Простые.
• Сложные.
• Комбинированные

Часто кисты являются компонентом фиброзно-кистозной мастопатии (дисплазии) молочных желез. Фиброзно-кистозная мастопатия наиболее выявляемое состояние при УЗИ молочных желез у женщин репродуктивного возраста. Поводом для обращения на УЗИ молочных желез чаще всего является болевой синдром. При мастопатии характерным признаком УЗИ молочных желез является уплотнение соединительной ткани, умеренное расширение протоков молочных желез, наличие мелких кист. Эти проявления у каждой женщины абсолютно индивидуальны.

Солидные доброкачественные образования при УЗИ молочных желез:

• Фиброаденома молочной железы доброкачественная опухоль молочной железы.
• Галактоцеле образование, связанное с накоплением секрета протоков молочной железы.
• Абсцесс молочной железы образование гнойно-воспалительного происхождения. И т.д.

Злокачественные образования молочных желез (рак молочной железы на УЗИ)

• Внутрипротоковая карцинома молочной железы
• Инвазивная протоковая карцинома молочной железы
• Другие виды карциномы молочной железы (медуллярная, тубулярная и т.д.)
• Цистосаркома молочной железы
• Лимфома молочной железы
• Хлорома молочной железы
• Саркома молочной железы

Когда делать УЗИ молочных желез

УЗИ молочных желез рекомендуется выполнять, придерживаясь определенных дней менструального цикла, если женщина не применяет гормональные контрацептивы и не находится в периоде менопаузы.Киста молочной железы

Дни цикла для УЗИ молочных желез с 8 по 14 являются наиболее предпочтительными. Если женщина уже не имеет менструаций, либо она применяет гормональную контрацепцию любого вида день цикла для проведения УЗИ молочных желез не имеет значения.

Симптомы, при которых необходимо провести УЗИ молочных желез:

• Боли в молочной железе, связанные или не связанные с менструальным циклом.
• Травма молочной железы.
• Изменение окраски, плотности, вида кожи груди, появление втянутых мест на молочной железе, в том числе, при втяжении соска.
• При обнаружении уплотнения или уплотнений при самостоятельном осмотре молочных желез.
• Увеличение одной или обеих молочных желез.
• Увеличение подмышечных лимфоузлов.
• Генетическая предрасположенность к доброкачественным или злокачественным образованиям молочных желез.
• Выявление патологии по гинекологии, например при проведении УЗИ матки, УЗИ яичников (трансвагинальное УЗИ), при наличии дисплазии шейки матки, эрозии шейки матки. Это связано с тем, что репродуктивные женские органы (матка, придатки) в своей работе, так же, как и молочные железы высоко чувствительны к гормональным изменениям и совметсно могут демонстрировать это наглядно в виде комбинированной патологии этих органов.

Подготовка к УЗИ молочных желез

Специальнаяподготовка не требуется. Профилактический осмотр молочных желез проводят в первую фазу цикла. При обнаружении тревожных симптомов, перечисленных выше, УЗИ молочных желез проводится в ближайшее время.

УЗИ молочных желез рекомендуется делать всем без исключения женщинам 1 раз в год в качестве профилактического скрининга. Узи молочных желез абсолютно безопастный и информативный вид диагностики состояния молочной железы и исключения риска рака молочной железы. Возрастные рамки применения именно УЗИ молочной железы для исключения рака молочной железы перестали быть ограничены 35 годами женщины с появлением высокоразрешающей аппаратуры с эффектом эластографии и чувствительного дуплексного сканирования сосудов. Эластография позволяет проводить дифференциальную диагностику образований по их плотности и смещаемости у женщин любого возраста. В нашей клинике установлен современный ультразвуковой сканнер с эластографией, позволяющий провести УЗИ диагностику молочных желез максимально информативно и качественно.

Гиперплазия грудных желез — лечение гиперплазия молочных желез в Киеве, гиперплазия молочных желез лечение в клинике

Синонимизация понятий

Название «гиперплазия железистой ткани молочных желез» знакомо мало кому. Это объясняем тем, что у болезни немало синонимов, которые на слуху. Самые узнаваемые:

Дисгормональная гиперплазия	Железистая дисплазия груди	Гиперплазия эпителия молочной железы
Диффузная дисгормональная фиброзно-кистозная болезнь	Очаговая гиперплазия	Протоковая фиброзно-кистозная болезнь
Атипичная протоковая гиперплазия	Узловые фиброзно-кистозные изменения	Дольковая гиперплазия молочной железы
Жировая гиперплазия	Доброкачественные опухоли

Симптоматика заболевания

Если с вопросом «Что такое гиперплазия?» мы разобрались, нужно понять, как диагностировать болезнь. Как правило, она протекает скрытно и долгое время женщина даже не догадывается о проблеме. Диагностировать болезнь может врач-маммолог после пальпационного осмотра и обследования с помощью УЗИ-сканера или маммографа. При самоосмотре поводом для беспокойства могут стать такие симптомы:

• наличие в молочных железах фиксированных узелковых уплотнений размером от 0,5 до 1,5 мм в диаметре;
• повышенная чувствительность и болезненность груди в первые дни менструального цикла;
• увеличение размера бюста без видимых для этого причин, отечность в отдельных зонах;
• прозрачные, водянистые или молочные выделения из соска, которые не связаны с беременностью или периодом лактации;
• увеличение лимфатических узлов возле груди, болевые ощущения в плече и подмышечной впадине.

Обратите внимание, что это общие особенности, которые сопровождают процессы деформации ткани молочной железы. У каждой формы болезни своя симптоматика. Например, железистая дисплазия груди сопровождается безболезненным течением, а опухолевые новообразования дискообразны и подвижны.

Запись к маммологу на осмотр

• Спасибо!

  Мы получили заявку и свяжемся
  с вами в течение 20 минут.

Причины гиперплазии

Заболевание встречается у женщин от 20 лет. Предрасполагающими факторами к развитию воспалительного процесса считают гормональные нарушения в организме, генетическую предрасположенность, пережитые стрессы и заболевания эндокринной системы. Также болезнь развивается на фоне длительного периода грудного вскармливания, контакта с вредными химическими веществами, из-за механических травм груди и приема гормональных препаратов.

Указанные причины для развития гиперплазии молочных желез пациенту на первый взгляд не кажутся связанными и серьезными грудными заболеваниями. На практике же это повод для беспокойства со стороны врача-маммолога. Лечение гиперплазии молочных желез разной сложности не будет эффективным, если качественно не устранить при этом первопричину. В противном случае возможен рецидив.

Фото 1. Хорошо распознается — хорошо лечится

Риск развития онкологии

Большинство видов гиперплазии не требуют радикального лечения. Принимая во внимание тип и стадию заболевания, врач составляет план действий. Если это ранняя фаза — выявляет и устраняет причины появления уплотнения в груди. Если же в молочной железе обнаружено новообразование большого размера или у женщины атипичная гиперплазия, может понадобиться оперативное вмешательство.

Мы в Специализированном маммологическом центре предоставляем все услуги по лечению: от диагностики и постановки диагноза до операций и послеоперативного наблюдения. Каждой пациентке клинки подробно рассказываем о результатах исследования, простыми словами объясняем сложную медицинскую терминологию и отвечаем на интересующие вопросы.

В медцентре работают врачи высшей категории, которые ежегодно повышают навыки на профильных конференциях, форумах и симпозиумах. Помимо маммологов и диагностов, у нас есть эндокринолог, который имеет 10+ лет опыта в решении гормональных проблем у женщин. Чтобы поставить единственно правильный диагноз и определить нужное лечение, они могут собраться на врачебный совет.

Аппаратное обследование проводим с применением техники экспертного класса. Она позволяет нам увидеть малейшие изменения в ткани молочной железы на ранней стадии.

Обследование у маммолога каждой женщине нужно проходить минимум раз в год. Если вы давно не были у врача, записывайтесь на прием по номеру 044-344-65-28 или оставляйте заявку на сайте.

Спасибо!

Мы получили заявку и свяжемся
с вами в течение 20 минут.

ДИАГНОСТИКА МАСТОПАТИЙ | ГБУ РО «ОЦОЗС и Р»

дополняет и уточняет патологическую картину груди, а при обследовании женщин до 35 лет является методом выбора. Эхография позволяет четко выявить множественные или одиночные кисты в груди, провести дифференциальную диагностику солидных образований и кист. Кисты выглядят в виде эхонегативных образований. Проходя сквозь жидкостную среду, ультразвуковой сигнал оставляет за задней стенкой кисты дорожку усиленного эхосигнала. Кисты груди формируются по типу ретенционных кист, обычно имеют округлые очертания, хорошо отграничены и замкнуты, так как они не сообщаются с выводными протоками. Диагноз мастопатии ставится на основании клинического и инструментального обследовния. В некоторых случаях требуется цитологическая и гистологическая диагностика, определение гормонального статуса пациентки.

Комбинация и выраженность симптомов мастопатии значительно варьирует как среди различных пациенток, так и у одной и той же женщины в различные периоды жизни и фазы менструального цикла. Клинически бывает трудно отличить физиологические изменения в молочной железе от мастопатии. Поэтому в практике нередко встречается как гипер-, так и гиподиагностика мастопатии.

Для диагностики следует использовать весь арсенал доступных диагностических методов. Диагноз мастопатии должен быть подтвержден данными маммографического и/или эхографического обследований, а при необходимости — и данными морфологических исследований. Все обследования груди рекомендуется проводить на 7-14 дни менструального цикла, когда снижается перименструальный отек.

Анамнез

При сборе анамнеза регистрируют сроки возникновения симптомов, наличие и характер болей, синдрома предменструального напряжения, дисальгоменореи, выделений из сосков, операций на молочной железе; наличие и характер нарушений менструального цикла; перенесенные и сопутствующие заболевания половых органов, щитовидной железы, печени и другие, которые могут вызвать гормональные нарушения.

Маммография

Маммография исследование на специальных рентгеновских установках (маммографах) — наиболее информативный метод диагностики патологических изменений в молочной железе. Стандартную маммографию проводят в двух проекциях при дозированной компрессии желез: прямая (аксиальная) и косая под углом в 45 градусов проекции. Эти проекции дают максимально полный охват ткани груди и ретромаммарного пространства. Для более точной локализации патологических очагов осуществляют снимок железы в боковой проекции. Для уточнения состояния отдельных участков железы проводят прицельные снимки с помощью специальных тубусов, дающих локальную компрессию, с возможностью увеличения изображения.

При диффузной мастопатии

При диффузной мастопатии с преобладанием железистого компонента железистая ткань состоит из множества мелких очагов уплотнения без четких границ диаметром до 1 см, представляющих гиперплазированные железистые ходы и дольки. Структура железистого треугольника выглядит как ноздреватая, пористая. При преобладании фиброзного компонента на маммограммах выявляется уплотнение всей или значительной части железистой ткани, выделяются линейные тени утолщенных фиброзно-измененных млечных протоков. При этом нормальное расположение структур груди не нарушено, фиброзная строма имеет радиарную ориентацию от основания железы в сторону соска, сосок и кожа не изменены, ретромаммарное пространство не сужено. При преобладании кистозного компонента маммографическая картина напоминает аденоз; множественные мелкие кисты создают впечатление зернистости. При смешанной форме диффузной мастопатии на маммограммах определяется крупнопетлистый рисунок с множественными участками просветления различных размеров, единичные кистозные полости, округлой формы, с четкими контурами.

 

При узловой мастопатии

При узловой мастопатии на маммограммах на фоне диффузных изменений имеются одиночные или множественные очаги уплотнения с неровными, нечеткими контурами, без резких границ переходящие в окружающую ткань. В отличие от раковой опухоли, очаговое уплотнение при мастопатии имеет неоднородную структуру и не изменяет структурный рисунок ткани молочной железы.

Аденома и фиброаденома

Аденома и фиброаденома молочной железе на маммограммах выглядит в виде узла округлой или овальной формы с четкими, ровными или слегка волнистыми контурами. Небольшие фиброаденомы диаметром до 3 см обычно имеют однородную структуру, более крупные фиброаденомы чаще имеют неоднородную структуру. По интенсивности узел немного более плотный по сравнению с окружающей тканью железы. Вокруг опухоли часто виден прозрачный ободок жировой ткани. Фиброаденомы, так же как и рак молочной железы, обызвествляются примерно в 30% случаев, но характер кальцинатов другой: они немногочисленные, более крупные и бесформенные.
Наиболее информативным методом диагностики внутрипротоковых папиллом является дуктография.

Ультразвуковая диагностика (УЗИ)

УЗИ дополняет и уточняет патологическую картину груди, а при обследовании женщин до 35 лет является методом выбора. Эхография позволяет четко выявить множественные или одиночные кисты в груди, провести дифференциальную диагностику солидных образований и кист. Кисты выглядят в виде эхонегативных образований. Проходя сквозь жидкостную среду, ультразвуковой сигнал оставляет за задней стенкой кисты дорожку усиленного эхосигнала. Кисты груди формируются по типу ретенционных кист, обычно имеют округлые очертания, хорошо отграничены и замкнуты, так как они не сообщаются с выводными протоками.

Морфологические методы обследований

Морфологические методы обследований при обычной мастопатии проводят не всегда, их обязательно применяют при подозрении на злокачественную опухоль груди. Для взятия клеточного и тканевого материала используют пункционную тонкоигольную аспирационную биопсию, трепан-биопсию — толстой режущей иглой, мазок-отпечаток выделений из сосков, эксцизионную биопсию со срочным гистологическим исследованием.

Анализ цитологических и гистологических препаратов

При анализе цитологических и гистологических препаратов можно выявить морфологические признаки фиброзно-кистозной болезни — пролиферацию эпителиальных клеток, атипию и атипичную пролиферацию эпителиальных клеток, разрастание соединительной ткани. При отсутствии подозрений на рак груди у пациенток с мастопатией можно рекомендовать как малотравматичную пункционную тонкоигольную аспирационную биопсию уплотнений в ткани желез. Последующий цитологический анализ позволяет выявить гиперпролиферацию и атипию эпителия.

Гистологическая структура

По гистологической структуре доброкачественные опухоли молочной железы делят на простую аденому — паренхима преобладает над стромой; фиброаденому — примерно равное соотношение паренхимы и стромы; аденофиброму — выраженное преобладание стромы, содержит единичные железы; фиброму — состоит только из стромы. Наиболее часто встречается фиброаденома. В свою очередь, фиброаденому классифицируют как тубулярную — железы не строят долек, имеют разный диаметр и форму, строма представлена плотной волокнистой соединительной тканью с небольшим количеством щелевидных сосудов; периканаликулярную — концентрическое разрастание соединительной ткани вокруг базальной мембраны протоков, просвет протоков сужен, но сохранен; интраканаликулярную — удлинение железистых протоков, пучки коллагеновых волокон в просвете протоков, располагающихся перпиндикулярно базальной мембране. Чаще всего встречается смешанный тип фиброаденомы с преобладанием тубулярных структур.

Внутрипротоковая папиллома гистологически состоит из множества сосочков. Периферия сосочка представляет собой паренхиму, сформированную из разрастающегося покровного эпителия. В эпителии сохраняется полярность клеток, целостность собственной мембраны, клеточный атипизм выражен слабо. Строма опухоли расположена в центре сосочка.

Пункционная тонкоигольная аспирационная биопсия с цитологическим исследованием аспирата

При кистозных образованиях в груди обязательным является пункционная тонкоигольная аспирационная биопсия с цитологическим исследованием аспирата. Пункционная биопсия позволяет получить из кисты желтоватую опалесцирующую серозную жидкость. При обычных кистах аспират не содержит клеток и состоит из нейтральных гликозаминогликанов и белка. При наличии разрастаний на стенках кисты в аспирате присутствуют в большом количестве эпителиальные клетки. Темный кровянистый или бурый цвет содержимого кисты является признаком пристеночной папилломы или карциномы. Цитологический анализ позволяет выявить наличие гиперпролиферации и атипии эпителия, поставить диагноз папилломы или карциномы внутренней поверхности капсулы кисты. Пристеночные разрастания доброкачественной или злокачественной природы появляются в полости кисты в 1-3% случаев.

Листовидная (филлоидная) опухоль

Листовидная (филлоидная) опухоль — редкая патология молочной железы. Макроскопически на разрезе узел имеет характерную слоистую структуру. Гистологически опухоль имеет вид интраканаликулярной или смешанной фиброаденомы с кистозно-расширенными протоками, в просвет которых обращены соединительнотканные выросты, характерны очаги некроза и кровоизлияний. От обычной фиброаденомы филлоидная опухоль отличается тем, что соединительная ткань не подвергается фиброзу, а становится многоклеточной и псевдосаркоматозной. Листовидная опухоль, хотя и является добокачественной, может рецидивировать после удаления и даже метастазировать.

Обследование гормонального статуса

Обследование гормонального статуса важно для выбора лечебной тактики у больных мастопатией. Гормональный профиль в 1 й — фолликулиновой фазе (7-9 день) и во 2 й — лютеиновой фазе (20-22 день) менструального цикла оценивают с помощью кольпоцитологического, радиоиммунологического (РИА) и иммуноферментного (ИФ) методов. При этом может потребоваться определение уровней, эстрогенов, прогестерона, тиреоидных гормонов, пролактина.

 

Что такое кальцинаты молочной железы?

Что такое кальцинаты молочной железы? 24.04.2020 20:30

Пациенты Клиники женского здоровья часто спрашивают, стоит ли беспокоиться из-за появления кальцинатов в молочной железе. Наши специалисты подготовили ответы на самые популярные вопросы.

 

1. Что такое кальцинаты молочной железы?
Кальцинаты представляют собой небольшие «точки» — отложения солей кальция, — которые могут встречаться в любой части ткани молочной железы. Они очень маленькие, поэтому вы не можете их почувствовать, и они не причиняют никакого дискомфорта.

2. Это как-то связано с употреблением большого количества молочных продуктов? Мне стоит пересмотреть свой рацион?
Кальцинаты не связаны с количеством кальция в вашем рационе. Они также не могут перерасти в рак молочной железы. Скорее, они являются «маркером» для некоторого основного процесса, который происходит в ткани молочной железы. В большинстве случаев процесс доброкачественный (не связанный с онкологией). Например, по мере старения человека появляется больше возможностей для доброкачественных изменений клеток, которые могут привести к кальцификации. Иногда железистые клетки могут выделять кальций в протоки — в конце концов, задача молочной железы состоит в том, чтобы производить молоко, даже если у вас никогда не было детей.

3. Какие еще могут быть причины возникновения кальцинатов?
Причинами возникновения кальцинатов в молочной железе могут быть так же:

перенесенные травмы или инфекционные процессы в молочной железе

 

предшествующее хирургическое вмешательство на молочной железе

 

доброкачественные образования в молочной железе, такие как фиброаденомы  (распространенный тип доброкачественного образования молочной железы) или кисты молочной железы (заполненные жидкостным содержимым образования)
 

прошедшая лучевая терапия молочной железы

 

накопление кальция в кровеносных сосудах внутри молочной железы (аналогично процессу, который вызывает накопление кальция в кровеносных сосудах по всему телу, называемого атеросклерозом)

 

Но иногда кальцинаты могут быть «маркером» развития рака. Из-за этого вам могут потребоваться дополнительные обследования, чтобы проверить, какие у вас кальцинаты.

4. Какие есть способы обнаружения кальцинатов молочных желез?
Кальцинаты обычно обнаруживаются случайно во время плановой маммографии или во время обследования по поводу другой проблемы с грудью. Кальцинаты выглядят на маммограмме как маленькие белые точки.
После проведения маммографии полученные изображения просматриваются рентгенологом. 

Найдя кальцинаты, врач внимательно изучает:

• их размер: большие («макро») или маленькие («микро»)
• их форму: округлая или линейная
• их распространенность: одиночные или множественные, рассеянные по ткани молочной железы или сгруппированные

Далее врач-рентгенолог классифицирует кальцинаты как доброкачественные, подозрительные на рак или злокачественные.

5. Надо ли лечить кальцинаты?
Если кальцинаты по данным обследования выглядят доброкачественно, больше ничего делать не нужно. Их не следует удалять, они не причинят вам никакого вреда.
В случае, если кальцинаты выглядят подозрительными или злокачественными, вам понадобится дообследование, так как во многих случаях только маммография не дает достаточно информации. Это не всегда значит, что что-то не так, просто дополнительные обследования помогут поставить точный диагноз.

Дообследование обычно проводится в амбулаторных условиях и может включать:

• Прицельный рентгеновский снимок пораженного участка с увеличением
• Ультразвуковое исследование
• Трепан-биопсия под рентгеновским наведением

Все необходимые обследования и консультации врачей-специалистов при выявлении кальцинатов молочных желез вы можете получить в нашей клинике!

УЗИ яичников

Яичники – парный орган репродуктивной женской системы. Располагаются яичники в малом тазу. Структурный аппарат яичникасостоит из фолликулов и стромы яичника. В норме яичники не имеют оболочки, и созревшийфолликулбез затруднения способен лопнуть во время овуляции и выпустить яйцеклетку. Выход яйцеклетки из фолликула и называется овуляция. Происходит овуляция под воздействием высоких уровней (пиков) лютеинизирующего  гормона, вырабатываемого в головном мозге. Этот гормон способем вовремы выброситься в кровоток только при нормальной работе самих яичников, посылающих гормональные сигналы в головной мозг. Строма яичников – это соединительная ткань,  содержащая кровеносные сосуды, по которым происходит доставка всех необходимых веществ к фолликулам  яичников для их полноценной работы.

 

УЗИ яичников позволяет безопастно и достоверно изучить яичники, в первую очередь, их структуру. УЗИ яичников можно проводить через живот абдоминальным датчиком и с помощью трансвагинального УЗИ. Трансвагинальное УЗИ – наиболее достоверный и точный метод УЗИ яичников.

 

 

Показание к обследованию:

• боли внизу живота;
• подготовка к беременности;
• болевые ощущения при половом акте;
• менструальные боли; — нарушение цикла;
• заболевание молочных желез;
• воспалительные процессы придатков;
• наблюдение в процессе динамики ЭКО;
• подозрение на патологию;
• профилактические осмотры.

 

 

УЗИ позволит вовремя выявить множество патологий в организме, некоторые заболевания можно определить еще на доклинической стадии (параовариальные кисты, опухоли, эндометриоидные кисты и т.д.). Ультразвуковое исследование поможет оценить фолликулярный аппарат, структуру яичников.

 

Если в ходе диагностики выявлено новообразование, врачу сложно понять доброкачественное оно или нет. Для этого нужно цветовое картирование, в основе которого допплеровский метод. Допплер измеряет скорость кровотока в органе, при злокачественной опухоли он значительно отличается.

 

Благодаря УЗИ можно вовремя диагностировать поликистоз яичников – заболевание, развивающееся на фоне гормонального сбоя, вследствие развивается хроническая ановуляция и далее бесплодие.

 

 

 

Подготовка к узи яичников

Специальной подготовки к УЗИ яичников не требуется, за исключением случаев, описанных выше, когда на УЗИ не видно яичников.

 

 

Как делают узи яичников

Узи яичников с наполнением мочевого пузыря через живот  — переднюю брюшную стенку (абдоминальным датчиком).
Узи яичников трансвагинальным датчиком (трансвагинальное УЗИ).
Узи яичников ректальным датчиком (у девственниц, при неудовлетворительных результатах УЗИ через живот, при атрезии (заращении) или резком стенозе (сужении) входа во влагалище – чаще у пожилых пациенток после перенесенных операций на промежности).

УЗИ яичников

Акушерство и гинекология Диагностика УЗИ УЗИ яичников

Яичники – парный орган репродуктивной женской системы. Располагаются яичники в малом тазу. Структурный аппарат яичникасостоит из фолликулов и стромы яичника. В норме яичники не имеют оболочки, и созревшийфолликулбез затруднения способен лопнуть во время овуляции и выпустить яйцеклетку. Выход яйцеклетки из фолликула и называется овуляция. Происходит овуляция под воздействием высоких уровней (пиков) лютеинизирующего  гормона, вырабатываемого в головном мозге. Этот гормон способем вовремы выброситься в кровоток только при нормальной работе самих яичников, посылающих гормональные сигналы в головной мозг. Строма яичников – это соединительная ткань,  содержащая кровеносные сосуды, по которым происходит доставка всех необходимых веществ к фолликулам  яичников для их полноценной работы.

УЗИ яичников позволяет безопастно и достоверно изучить яичники, в первую очередь, их структуру. УЗИ яичников можно проводить через живот абдоминальным датчиком и с помощью трансвагинального УЗИ. Трансвагинальное УЗИ – наиболее достоверный и точный метод УЗИ яичников.

УЗИ яичников норма

Нормальные размеры яичников при УЗИ яичников составляют до 12 мл³ для каждого яичника. При нормальном УЗИ яичников в них можно насчитать до 12 фолликулов в каждом. Обнаружение при УЗИ яичников числа фолликулов менбше 5 в двух яичниках вместе – неблагоприятный признак, свидетельствующий чаще всего о преждевременном истощении яичников. При УЗИ яичников норма  строма яинников содержит умеренное количество кровеносных сосудов, средней эхогенности, сравнимой по оттенку цвета с маткой. Повышение эхогенности стромы яичников, увеличение размеров, наличие в них множественных сосудов при УЗИ яичников может свидетельствовать о патологии (поликистоз яичников, воспаление яичников). При УЗИ яичников в норме яичники располагаются с двух сторон от матки, у правого и левого ребра матки. Яичники могут прилежать к матке или находится на небольшом расстоянии от матки – это норма УЗИ яичников. В подавляющем большинстве случаев, при УЗИ яичников, особенно трансвагинальном УЗИ, трудностей в обнаружении яичников нет.

На УЗИ не виден яичник в случае его удаления при операциях, врожденном отсутсвии одного или двух яичников, резком уменьшении яичника вследствие преждевременного истощения или нормального климактерического периода, особенно при выраженном вздутии петель кишечника, резком изменении места расположения яичников в сзязи с выраженной спаечной болезнью органов малого таза. Если на УЗИ не виден яичник, и нет причин полагать, что он отсутствует, проводится УЗИ яичников после подготовки. Подготовка состоит в очищении кишечника с снятии вздутия (фортранс, очистительная клизма, эспумизан перед УЗИ яичников).  Нормальные фолликулы в яичнике, которые доступны визуализации при проведении УЗИ яичников имеют размеры от 1 мм до 30 мм. Размеры фолликула более 30 мм при УЗИ яичников свидетельствуют об образовании фолликулярной (функциональной) кисты яичника. Обнаружение кисты яичника при УЗИ не составляет трудностей.  Киста яичника на УЗИ выглядит как шар разной степени окрашивания и структуры.

По характеру структуры и оттенка цвета киста яичника при УЗИ может быть:

1. Фолликулярная киста яичника (функциональная киста яичника).
2. Киста желтого тела яичника.
3. Эндометриоидная киста яичника
4. Тератодермоидная киста яичника (тератома яичника, дермоидная киста яичника).
5. Цистаденома и т.д.

Проведение УЗИ яичников однократно не дает всех ответов на вопросы о функционировании яичников. В течении одного менструального цикла структура и внешний вид яичников при УЗИ меняется. Сразу после менструации при УЗИ яичников в норме видны фолликулы, размерами до 8 мм. Через 9-16 дней от первого дня менструации при УЗИ яичников наблюдается один крупный фолликул. Если его размер 10-17,9 мм – такой фолликул называется доминантным. В норме таких фолликулов при проведении УЗИ яичников может быть несколько или один. В предовуляторный период (день менструального цикла 11-18) обнаруживается при УЗИ яичников  фолликул, размерами 18-30 мм. Такой фолликул называется преовулятрным. При нормальной гормональной регуляции в течении нескольких часов или суток происходит овуляция. Чаще всего, такой преовуляторный фолликул, обнаруживаемый при УЗИ яичников, один.

После овуляции при УЗИ яичников на месте овулировавшего фолликула можно увидетьжелтое тело. Суть его раборы – обеспечение прогестероном вторую фазу цикла. Прогестерон необходим для развития беременности на ранних сроках, пока нет полноценного формирования плаценты. Если не наступает беременность, желтое тело вырабатывает прогестерон для нормальной трансформации эндометрия и подготовки его к отторжению во время предстоящей менструации. При проведении Узи яичников после овуляции (с 12 до 28 дня цикла) можно оценить структуру желтого тела. При проведении анализа кровотока в желтом теле при УЗИ яичников с применением допплера, можно достоверно предполагать нормальность его функционирования. При неадекватной работе желтого тела при УЗИ яичников наблюдается отсутсвие выраженного низкорезистентного кровотока, желтое тело может быть кистозное, увядает раньше срока ( приблизительно на 22  день цикла).  Это называется недостаточностью желтого тела. У женщин с недостаточностью желтого тела может наблюдаться короткие менструальные циклы (менее 26 дней), бесплодие, кровотечения во время менструации (в связи с гиперплазией эндометрия), мажущие выделения перед менструацией. При Узи яичников после овуляции приблизительно  на  18 и на 23 дни цикла можно в динамике оценить, нормально ли работает желтое тело. Для точного анализа дополнительно исследуется прогестерон в крови.

Естественно, УЗИ яичников не проводится изолированно.  Вместе с УЗИ яичников проводится УЗИ матки,более информативно УЗИ вагинальным датчиком. Такое УЗИ называетс трансвагинальное УЗИ.

Подготовка к УЗИ яичников

Специальной подготовки к УЗИ яичников не требуется, за исключением случаев, описанных выше, когда на УЗИ не видно яичников.

Как делают УЗИ яичников

• Узи яичников с наполнением мочевого пузыря через живот  — переднюю брюшную стенку (абдоминальным датчиком).
• Узи яичников трансвагинальным датчиком (трансвагинальное УЗИ).
• Узи яичников ректальным датчиком (у девственниц, при неудовлетворительных результатах УЗИ через живот, при атрезии (заращении) или резком стенозе (сужении) входа во влагалище – чаще у пожилых пациенток после перенесенных операций на промежности).

Строма эндометрия обычно компактна, и предопределенные изменения …

Проблемы женского здоровья обычно недостаточно представлены в фундаментальных и трансляционных исследованиях, но репродуктивному здоровью, в частности, мешает отсутствие понимания базовой физиологии матки и менструального цикла. Менструальное здоровье является неотъемлемой частью общего состояния здоровья, поскольку в период между менархе и менопаузой у большинства женщин наступает менструация. Тем не менее, для десятков миллионов женщин во всем мире регулярные и часто катастрофические менструации нарушают их физическое, умственное и социальное благополучие.Улучшение нашего понимания основных явлений, связанных с менструацией, аномальным маточным кровотечением (AUB) и другими нарушениями, связанными с менструацией, приблизит нас к цели индивидуального ухода. Кроме того, более глубокое механистическое понимание менструации — быстрого, безрубцового процесса заживления у здоровых людей — вероятно, даст представление о множестве других заболеваний, связанных с местной и системной регуляцией сосудистой функции. Мы также признаем, что многие женщины сейчас откладывают беременность и что растет желание фертильности и сохранения матки.В сентябре 2018 года Отделение гинекологического здоровья и болезней Национального института здоровья детей и развития человека Юнис Кеннеди Шрайвер (GHDB NICHD) провело двухдневную встречу «Менструация: наука и общество» с целью «выявить пробелы и возможности. в науке о менструации и повысить осведомленность о необходимости проведения дополнительных исследований в этой области ». Эксперты в различных областях, от эволюционной роли менструации до базовой биологии эндометрия (включая атомный анализ эндометрия, стволовых клеток и тканевую инженерию эндометрия, микробиома эндометрия, а также AUB и миомы), трансляционной медицины (методы визуализации и взятия образцов, ориентированный на пациента анализ нарушений менструального цикла, включая AUB, интеллектуальные технологии / приложения и платформы мобильного здравоохранения), социальные проблемы в области санитарной грамотности и распространения информации в различных экономических и культурных ландшафтах. начало встречи.Здесь мы предоставляем расширенный отчет о встрече с обширным актуальным (на момент отправки) контекстом, охватывающим спектр от того, как основные процессы менструации начинаются в ответ на отмену прогестерона, через роль резидентных и циркулирующих стволов в тканях и клетки-предшественники в ежемесячной регенерации — и текущие пробелы в знаниях о том, как нарушение регуляции приводит к AUB и другим нарушениям, связанным с менструальным циклом, таким как аденомизоз, эндометриоз и миома, — до клинических проблем в диагностике, лечении, обучении пациентов и общества.В заключение мы сделаем обзор того, как глобальная повестка дня, касающаяся менструации, и особенно менструального здоровья и гигиены, набирает обороты, начиная от увеличения инвестиций в устранение связанных с менструациями барьеров, с которыми сталкиваются девочки в школах в странах с низким / средним уровнем дохода, до недавних Движения за «менструальную справедливость» и «период бедности» распространяются по странам с высоким уровнем доходов.

Гиперплазия стромы эндометрия: недооцененное состояние

Гиперплазия стромы эндометрия — это плохо распознаваемое поражение, не имеющее широкого признания, при этом большинство, если не все, таких случаев, описанных в литературе, как узелки стромы эндометрия или саркомы стромы эндометрия низкой степени злокачественности.В этой статье мы описываем три примера «гиперплазии стромы эндометрия», которые имеют замечательное морфологическое сходство с нормально пролиферирующей стромой эндометрия и стромальными новообразованиями эндометрия, но которые также обладают небольшими, но достаточными различиями, чтобы оправдать их таксономическое разделение.

1. Введение

Гиперпластический процесс в эндометрии по большей части диффузный, вовлекает как железы, так и строму (простая гиперплазия), реже является очаговым или мультифокальным и поражает исключительно железы эндометрия (сложная гиперплазия и обычно атипичная гиперплазия) [1].О гиперплазии эндометрия, состоящей исключительно из стромальных клеток, сообщалось в литературе только в исключительных случаях [2], в основном потому, что эти поражения не распознаются как патологические образования, отличные от стромального узла эндометрия и стромальной саркомы эндометрия низкой степени злокачественности. Мы сообщаем здесь о трех таких случаях гиперплазии эндометрия стромы и раскрываем ее тонкие, но уникальные особенности, для которых эта форма гиперплазии заслуживает отдельного рассмотрения.

2. Случай 1

71-летняя женщина была направлена ​​для оценки толстого эндометрия, обнаруженного при обычном ультразвуковом обследовании в рамках ее ежегодного осмотра.В анамнезе пациентка перенесла левую колэктомию по поводу аденокарциномы слепой кишки 3 года назад и полипэктомию по поводу тубуловиллярной аденомы толстой кишки 2 года назад. Несколько лет страдала артериальной гипертонией. Гормональной терапии в анамнезе не было. У пациентки было два нормальных родоразрешения и два искусственных аборта. При гистероскопической биопсии был получен фрагмент ткани размером 0,5 см ² вместе с небольшим полипом эндометрия 0,7 см при максимальном диаметре.

При гистологическом исследовании более крупный фрагмент был сформирован, почти полностью, из листов мелких однородных клеток, с ядрами яйцевидной или веретеновидной формы, со скудной цитоплазмой и нечеткими границами клеток (рис. 1 (а)).Обнаружено замечательное сходство со стромальными клетками нормального эндометрия позднего пролиферативного типа. Полип эндометрия содержал небольшую область диаметром 0,2 см, которая однородно состояла из плотной стромы эндометрия того же типа, что и на фрагменте эндометрия (рис. 1 (b)). Оба образца не имели цитологической атипии, митотической активности или инвазии лимфатических сосудов. Биопсия была описана как «поражение стромы эндометрия» «гиперплазия стромы» стромальный узелок эндометрия.После этого у пациента отсутствуют какие-либо симптомы, а последующее ультразвуковое исследование показало нормальную толщину эндометрия и миометрия. Через год после лечения пациент жив-здоров. Ввиду нормального ультразвукового исследования, отсутствия каких-либо симптомов и после просмотра слайдов, о которых сообщалось ранее, мы расценили этот случай как гиперплазию стромы эндометрия.

3. Случай 2

47-летняя женщина была направлена ​​на гинекологическую консультацию к семейному врачу в связи с 30-месячным анамнезом аномального вагинального кровотечения.У нее было двое детей, оба родились путем кесарева сечения. При физикальном обследовании выявлены множественные лейомиомы матки. В анамнезе она сделала левую овариэктомию по поводу муцинозной цистаденомы 5 лет назад. Гормональная терапия не получала. Выполнены тотальная абдоминальная гистерэктомия и правая сальпингоофорэктомия.

Образец гистерэктомии содержал множественные типичные лейомиомы. Был распространен аденомиоз. Шейка матки в норме. В эндометрии обнажился плотный клеточный полип 0.6 см в наибольшем диаметре, полностью состоит из маленьких веретеновидных клеток с небольшой цитоплазмой и нечеткими границами клеток (рис. 1 (c)). На всем протяжении поражения видны толстостенные сосуды артериолярного типа. Сходное морфологическое поражение с сосудами аналогичного типа было замечено в эндометрии на площади 0,8 см, расширяясь в окружающий миометрий с гладкой сдвигающейся границей (рис. 1 (d)). Ни в одном из двух поражений не было цитологической атипии, митотической активности или инвазии лимфо-сосудистого пространства.Был диагностирован гиперплазия стромы эндометрия. В правом яичнике обнаружена муцинозная цистаденома. Пациентка остается здоровой в течение трех лет после удаления матки.

4. Случай 3

75-летняя женщина обратилась с жалобой на сильное аномальное вагинальное кровотечение в течение недели. У нее было две нормальные роды. Пациентка страдала ожирением, гипертонией, имела эндометрий толщиной 10 мм с двумя небольшими полипами, выступающими в полость эндометрия. В настоящее время она принимает тироксин от гипотиреоза; она не получала гормональную терапию.Диагностический и терапевтический выскабливание выявили четыре фрагмента эндометрия, полностью состоящие из небольших регулярных стромальных клеток с яйцевидными или веретеновидными ядрами и плохо выраженной цитоплазмой, напоминающей нормальную позднюю пролиферативную строму. Не было клеточного плеоморфизма, митотической активности или инвазии лимфо-сосудистых каналов. Клетки были расположены в виде листов, в которых присутствовало множество сосудов типа артериолярных клеток (рис. 1 (е)). Из двух полученных полипов один содержал железы пролиферативного типа в фиброзной строме; другой был образован исключительно из стромальных клеток с характеристиками, аналогичными описанным в эндометрии.Биопсия была описана как «поражение стромы эндометрия« стромальная гиперплазия »стромальный узел эндометрия». Последующее ультразвуковое исследование было нормальным. Пациент был жив и здоров в 14 месяцев. На основании клинических и гистологических особенностей, сонографических изображений и информации о последующем наблюдении этот случай был расценен как гиперплазия стромы эндометрия.

Иммуногистохимия была проведена во всех случаях и выявила диффузную положительную реакцию на ER (рис. 1 (f)), PR, виментин и bcl-2 и очаговую положительность на CD10.Они были отрицательными для α -актина гладких мышц, кальретинина.

5. Обсуждение

В настоящее время появились дополнительные доказательства того, что пролиферация клеток в эндометрии может принимать форму чистой стромальной гиперплазии — редкий, но специфический паттерн роста, который отличается от других форм пролиферативной активности на этом участке. Это неудивительно для динамической ткани, так как эндометрий, имеющий два основных структурных компонента, железы эндометрия и специализированную строму эндометрия, каждая из которых, по отдельности или в любой комбинации, обладает потенциалом для интенсивного разрастания и роста в ответ на соответствующие гормональные раздражители.В этом отношении было признано, что продолжительная эстрогенная стимуляция эндометрия без сопротивления может привести к гиперпластическому росту, который включает оба компонента эндометрия, то есть железы и строму (простая гиперплазия), или может, реже, вызывают форму гиперплазии с пролиферацией, ограниченной железами эндометрия (сложная гиперплазия, атипичная гиперплазия) [1]; были идентифицированы аналогичные пролиферации, ограниченные стромой эндометрия, но этот образец роста традиционно считался неизменно неопластическим, либо доброкачественным (стромальный узел эндометрия), либо злокачественным (стромальная саркома эндометрия низкой степени, недифференцированная саркома) — точка зрения, которая не является отражают выводы настоящего отчета и, по всей видимости, нуждаются в пересмотре.

Мнение о том, что пролиферация стромальных клеток в эндометрии по определению является неопластической, было впервые оспорено Stewart et al. [2], когда они столкнулись с серией из двух биопсий эндометрия и последующей гистерэктомией у молодой женщины с меноррагией. Две биопсии показали нормальный образец пролиферации эндометрия с примесью небольших тканевых фрагментов плотной стромы эндометрия. Возможность того, что это доброкачественные стромальные опухоли, учитывалась в биопсийном материале, но исключалась в образце гистерэктомии, где по причинам, которые будут обсуждены позже, был поставлен диагноз фокальной гиперплазии стромы эндометрия.Это единственный полностью задокументированный случай гиперплазии стромы эндометрия в литературе, и к этому мы добавили три настоящих случая. Еще о трех случаях сообщили Vanni et al. [3] при исследовании транслокаций в полипах эндометрия, но их отчет был кратким и неполным.

Немногочисленные примеры гиперплазии стромы эндометрия, зарегистрированные до сих пор, представляют собой лишь приблизительную оценку ее истинной частоты и для многих случаев не были зарегистрированы, в то время как другие оставались нераспознанными и регистрировались как стромальные узелки эндометрия или стромальные саркомы эндометрия низкой степени, это во многом объясняется тем, что диагностическая метка гиперплазии стромы не установлена.Тем не менее, эти примеры иллюстрируют то, что «чистые» пролиферации стромальных клеток эндометрия сами по себе не обязательно неопластические, но некоторые могут принимать форму гиперплазии стромы. Тем не менее, распознавание этой формы гиперплазии эндометрия и ее отделение от опухолей стромы эндометрия может представлять трудности, особенно в материале для выскабливания, гиперпластические поражения стромы гистологически очень похожи, почти идентичны тем, которые являются действительно неопластическими, и есть только тонкие морфологические различия и молекулярные транслокации, которые делают различие возможным.Фактически, анализ наших случаев показал, что несколько признаков имеют диагностическое значение в этом отношении.

Таким образом, согласно Stewart et al. По мнению [2], гиперплазия стромы эндометрия является полностью внутриэндометриальным поражением, возможно, распространяющимся в миометрий с толкающим, а не инфильтрирующим краем. Стромальные клетки, образующие очаги поражения, хотя и очень похожи на клетки стромы нормальной пролиферативной фазы, лишены митозов или обнаруживаются лишь изредка; они окрашивают положительно на CD10 и виментин, экспрессируют рецепторы эстрогена (ER) и прогестерона (PR), но отрицательны на актин и десмин.Размер поражений менее 1 см, и действительно, не было зарегистрировано ни одного случая, в котором гиперпластический элемент имел бы диаметр более 0,8 см. Кроме того, гиперплазии стромы имеют тенденцию образовывать небольшие полипы или развиваться в уже существовавшем полипе, который в образцах кюретажа может создавать впечатление мультифокального поражения, как описано другими [2]. Такие полипы эндометрия с преобладанием стромальной гиперплазии характеризуются транслокацией t (6; 14) (p21; q24) [3].

Напротив, новообразования типа стромальных узелков обычно большие, до 20 см в диаметре, со средним размером 5-6 см в диаметре, хотя они могут достигать 0,8 см [4]. Эти поражения могут быть внутриэндометриальными или полностью интрамуральными и, за очень немногими исключениями, одиночными. Многие из них полиповидны и расширяют полость матки. Опухоли обычно хорошо ограничены и расширяются, но, хотя они часто «выступают» на 3 мм в окружающие ткани, не имеют четких доказательств инвазии.Однако дальнейшее распространение в миометрий, то есть более 3 мм, и / или явное свидетельство инфильтрации сосудов указывает на то, что опухоль представляет собой саркому стромы эндометрия. Стромальные узелки компактны, с клетками, которые напоминают клетки нормально пролиферирующей стромы эндометрия, но могут проявлять некоторую ядерную атипию и редкую митотическую активность: <3 митозов на 10 мощных полей (HPF), но иногда может достигать 15 митозов на 10 HPF. Распространенной цитогенетической аномалией является t (7; 17) (p15q21) , которая приводит к слиянию гена JAZF1-JJAZ1 [5, 6].

Опухолевые клетки стромальных сарком эндометрия низкой степени злокачественности все еще напоминают нормальные стромальные клетки эндометрия, но могут проявлять митотическую активность (от <3 митозов до> 10 митозов на 10 HPF) и, возможно, области ядерного плеоморфизма. Однако отличительной особенностью этой опухоли является глубокая инвазия миометрия, обычно сопровождающаяся инвазией сосудистых каналов и редко метастазами. Опухоли, как и стромальные узелки, обнаруживают ген слияния JAZF1 / JJAZ1 , вызванный транслокацией t (7; 17) (p15; q21) [5, 6].Недифференцированные саркомы эндометрия — это откровенно инвазивные опухоли с кровотечением, некрозом и, возможно, метастазами; они могут проявлять большую степень плеоморфизма и митотической активности (от ≥10 митозов до ≥20 митозов на 10 HPF), но не имеют характерных молекулярных аберраций [5, 6].

Клинические особенности пациентов с гиперплазией стромы эндометрия во многом такие же, как и у женщин с новообразованиями стромальных клеток, наиболее частой жалобой является аномальное маточное кровотечение.Точно так же гиперпластическое состояние встречается в широком возрастном диапазоне, от до 1940-х годов до возраста старше 75 лет, в среднем 58 лет. После хирургического удаления матки и яичников часто встречались аденомиоз / эндометриоз и лейомиома матки, и, за исключением Stewart’s et al. В этом случае была высокая частота сосуществующих полипов эндометрия. Эти патологические особенности никоим образом не являются специфическими или характерными для этой конкретной формы гиперплазии, но, по-видимому, подразумевают, что преобладает эстрогенная среда.

Из этого обсуждения очевидно, что чистые пролиферации стромальных клеток в эндометрии не обязательно являются неопластическими, поскольку несколько описанных примеров, по-видимому, являются подлинно гиперпластическими по природе. Предполагается, что если поражение стромы имеет небольшой размер, локализацию внутри эндометрия и мультифокальное распределение, и если оно имеет тенденцию к образованию полипов или возникает в уже существующем полипе и не имеет сосудистой инвазии, то его можно рассматривать как гиперплазия стромы эндометрия.Специфический молекулярно-генетический тест, который может подтвердить диагноз в проблемных случаях, — это t (6; 14) (p21; q24) . Несмотря на короткое время наблюдения, считается, что любое гиперпластическое поражение без цитологической атипии и, в этом отношении, гиперплазия стромы эндометрия, вероятно, имеет благоприятный прогноз и, следовательно, заслуживает таксономического разделения.

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Секреторная фаза менструации и имплантации

Женская репродуктивная система подготавливает женский организм к зачатию и беременности через два различных цикла: цикл яичников и цикл эндометрия.Эндометрий человека под воздействием сложных биологических сигналов претерпевает циклические изменения при подготовке к имплантации и наступлению беременности. Множество молекулярной активности, все еще плохо изученной, приводит к относительно постоянным морфологическим изменениям эндометрия во время каждого цикла. В эпоху вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) постоянно возрастает потребность в определении этих путей, чтобы улучшить показатели наступления беременности. В конечном счете, успех в области репродукции и фертильности требует понимания этих сложных процессов, от молекулярных до клеточных и тканевых, как у здорового пациента, так и в условиях различных патологических состояний.

В этой главе будет обсуждаться цикл эндометрия с акцентом на секреторную фазу, включая молекулярные и биохимические компоненты восприимчивости и имплантации эндометрия. Будут рассмотрены маркеры и методы оценки восприимчивости, а также патологические состояния, влияющие на фертильность.

Эндометрий состоит из двух общих слоев: функционального и базального. Функциональный слой состоит из компактной зоны, включающей строму под просветным эпителием, и губчатой ​​зоны, которая лежит над базальным слоем [1,2].Миометрий находится под базальным слоем, который претерпевает меньше циклических изменений по сравнению с функциональным слоем и способен регенерировать функционалис после менструации (рис. 1).

Цикл эндометрия состоит из трех последовательных фаз — фазы пролиферации, секреторной фазы и менструации. Каждая фаза отмечена физиологическими изменениями, которые контролируются циркулирующими уровнями эстрогена и прогестерона, на которые, в свою очередь, влияет яичник.Яичниковый цикл характеризуется развитием фолликулов, опосредованным ФСГ (фолликулярная фаза), овуляцией, опосредованной выбросом ЛГ, а также развитием желтого тела и выработкой прогестерона (лютеиновая фаза). В идеальном 28-дневном цикле овуляция происходит на 14-й день, желтое тело становится атретичным на 28-й день, а менструация начинается на следующий день, 1-й день. После овуляции остаток доминирующего фолликула становится желтым телом, временной эндокринной структурой, которая производит прогестерон (рис. 1) [1-4].

Рисунок 1. Функциональная анатомия эндометрия человека во время секреторной фазы.

Во время фазы пролиферации эстроген запускает восстановление функционального слоя с реэпителизацией примерно к 5 дню менструального цикла. Эта фаза характеризуется гипертрофией и разрастанием желез, увеличением стромального матрикса и удлинением терминальных артериол до просвета эндометрия. Эстроген также активирует рецепторы прогестерона, которые регулируют окружающую среду во время секреторной фазы, что будет более подробно описано в следующем разделе [2,4].При отсутствии оплодотворения уровень прогестерона снижается из-за атрезии желтого тела. Это приводит к сосудистым изменениям, последующей гибели тканей и отторжению эндометрия или менструациям.

На протяжении десятилетий датирование эндометрия проводилось гистологически [4,5]. После овуляции наблюдается усиление поверхностного отека стромы, который становится генерализованным к 21 дню. Стромальные клетки около терминальных спиральных артерий показывают увеличение цитоплазмы и окружающей внеклеточной матрицы, процесс, называемый предцидуализацией, который в конечном итоге охватывает большую часть поверхностного эндометрия ко дню. 25.К 27 дню поверхностные стромальные клетки почти неотличимы от децидуальных клеток беременных. Усиление отека во время секреторной фазы приводит к глобальному утолщению эндометрия, что легко обнаруживается при ультразвуковом исследовании. На протяжении секреторной фазы также наблюдаются отчетливые изменения в спиральных артериях. Они быстро удлиняются, опережая утолщение эндометрия, и становятся все более спиралевидными [4-6,7].

Во время пролиферативной фазы наблюдается усиление митотической активности железистого эпителия и псевдостратификация ядер.Параллельно происходит увеличение пролиферации стромальных компонентов во время этой фазы. После овуляции этот процесс сменяется секреторной трансформацией желез и замедлением пролиферации стромы. На клеточном уровне железистых эпителиальных клеток ранняя секреторная фаза характеризуется обильным эндоплазматическим ретикулумом, накоплением богатых гликогеном вакуолей и смещением ядер в центре. Через шесть дней после овуляции потеря вакуолей из цитоплазмы соответствует максимальной секреторной активности желез [4,7].

Сложное взаимодействие между стромальными и иммунными клетками подчеркивает секреторную фазу поверхностного эндометрия. Значительная часть популяции лейкоцитов матки состоит из CD56- / CD16 + естественных киллеров матки (uNK), которые, как полагают, играют роль в аллораспознавании трофобластов плода, а не в цитотоксичности. Клетки uNK в основном обнаруживаются вблизи спиральных артерий и вневорсинчатых трофобластов на ранних сроках беременности. Популяция клеток резко увеличивается после овуляции и исчезает перед менструацией при отсутствии беременности.Было показано, что активность uNK-клеток контролируется региональными стероидными гормонами, а также местными хемокинами, включая те, которые содержат (мотив C-X-C) и различные интерлейкины [1,4].

Макрофаги (CD163 +) также обнаруживаются в поверхностном эндометрии, быстро накапливаются в строме после овуляции и уменьшаются в отсутствие прогестерона. Т-клетки обнаруживаются разбросанными по всему эндометрию с небольшими изменениями клеточного цикла или без них в концентрации, а также в дендритных клетках матки (uDC), которые более заметны в децидуальной оболочке беременных [4].

Конец секреторной фазы и начало предменструальной фазы характеризуются деградацией стромальной сети, инфильтрацией стромы лейкоцитами и прекращением активности желез при отсутствии соответствующих сигналов от ХГЧ. Разрушение стромальной сети катализируется матриксными металлопротеиназами (ММП), которые активируются при снижении уровня прогестерона. Признаки апоптоза очевидны по всей ткани, и исчезают плотные внутренние структурные изменения в железистых клетках, характерные для секреции [1,4].

Имплантация бластоцисты — это высокоорганизованный избирательный процесс, который, с некоторыми вариациями, сохраняется у многих видов. Он вращается вокруг «окна имплантации» (WOI), в течение которого эндометрий способен «принимать» трофэктодерму бластоцисты. Взаимодействие регулируется множеством молекул и в целом регулируется стероидными гормонами [4,7]. Более поздние исследования показывают, что WOI длится от 12 часов до 2 дней и часто смещается у пациентов с бесплодием [3].

В 1950 году Нойес и др. провели гистологическое исследование ранней имплантации человека и не обнаружили никаких изменений между ожидаемым небеременным эндометрием в средней секреторной фазе, за исключением вторжения трофобластов, смещающих соседние железистые структуры [5]. В 1999 году Wilcox et al. сократил время имплантации до 8–10 дней после овуляции, при этом увеличение потерь коррелировало с более поздней имплантацией [8].

Процесс имплантации состоит из нескольких хорошо описанных этапов, которые координируются с подготовкой эндометрия путем изменения стероидных гормонов.Фокус здесь начинается с аппозиции и временного прикрепления клеток синцитиального трофобласта к эпителию эндометрия, за которым следует прочное прикрепление и инвазия. Когда бластоциста попадает в полость матки, блестящая оболочка выпадает, что позволяет обнажить трофэктодерму [7,9]. Под действием прогестерона эпителиальные клетки эндометрия в секреторной фазе входят в гиперсекреторное состояние с ультраструктурными изменениями, описываемыми как реакция Ариаса-Стеллы . Это гиперсекреторное состояние ткани обеспечивает необходимое питание, необходимое для выживания эмбриона, поскольку ремоделирование сосудов происходит позже [10].

Молекулярная основа инвазии представляет активный интерес в этой области, поскольку отказ этих механизмов связан с потерей беременности. Текущие исследования показывают, что MUC1, большой трансмембранный муцин и барьер для имплантации подавляется и / или удаляется за счет действия поверхностных протеаз и снижения экспрессии рецепторов прогестерона. Потеря MUC1 делает возможным соответствующее сближение и прикрепление между эмбрионом и эндометрием. Первоначальное временное прикрепление опосредуется различными молекулами, включая селектины и галектины.Более прочное прикрепление опосредуется интегринами, включая ανβ3 и α4β1, а также CD44 и связанный с ними лиганд остеопонтин (OPN). Другие ассоциированные молекулы прикрепления включают трофинин, HB-EGF, фибронектин, витронектин, SPP1, ламинин, IGFBP1 и ассоциированный с латентностью пептид, связанный с TGFβ [2,3,4,7,9].

Специализированные поверхностные макромолекулярные структуры также участвуют в адгезии и инвазии бластоцист. Эпителий эндометрия состоит как из реснитчатых, так и из нересничных секреторных клеток, пропорции которых регулируются уровнем эстрогена.Секреторные клетки развивают временные поверхностные структуры в ответ на уровни прогестерона, называемые пиноподами, во время максимальной восприимчивости. Эти структуры участвуют в пиноцитозе и содержат различные молекулы адгезии, включая ανβ3 и OPN. Развитие пиноподов зависит от HOXA-10, гена гомеобокса, экспрессия которого жизненно важна для восприимчивости эндометрия, регулируя как пролиферацию стромальных клеток эндометрия, так и морфогенез эпителиальных клеток [11]. Блокирование экспрессии HOXA-10 показывает значительное снижение количества пиноподов.Хотя некоторые доказательства указывают на роль пиноподов в адгезии и инвазии эмбриона, их точная функция и общая важность все еще обсуждаются [2,3].

Адгезия через эти молекулы далеко не статический процесс. Внеклеточный контакт с соответствующими лигандами передает сигналы посредством множества процессов во внутриклеточные каскады, что приводит к транскрипции генов и экспрессии белков. Результирующий эффект включает адгезию, а также миграцию, пролиферацию и ремоделирование цитоскелета.Общий результат — инвазия эмбриона в примированный эндометрий, где он имеет потенциал для роста и развития [2-4].

Датирование эндометрия резко изменилось с момента установления критериев Ное для гистологического датирования в 1950 г. [5]. С более детальным пониманием биохимических путей, на которые влияют стероидные гормоны во время менструального цикла, появились новые цели для определения восприимчивости эндометрия. Первоначально анализировали одиночные молекулы.С появлением технологии микрочипов можно одновременно анализировать огромное количество молекул, чтобы получить гораздо более полную картину окружающей среды эндометрия [1,3,4].

Цитокины участвуют во многих процессах менструального цикла, и было показано, что они играют решающую роль в овуляции и имплантации. Фактор ингибирования лейкемии (LIF) относится к семейству IL-6, и его экспрессия была продемонстрирована в эпителии эндометрия человека во время средней и поздней секреторной фазы [11].У женщин с доказанной фертильностью биопсия эндометрия продемонстрировала экспрессию мРНК LIF с 18 по 28 день с пиком на 20 день менструального цикла с 2,2-кратным увеличением секреции LIF между пролиферативной и секреторной фазами [12]. IL-6, другой цитокин, экспрессируемый в эндометрии, демонстрирует регулируемую временную структуру на протяжении менструального цикла с наивысшими обнаруженными уровнями во время лютеиновой фазы. Уровни мРНК IL-6 прогрессивно увеличиваются во время средней и поздней секреторной фазы с сильной экспрессией во время окна имплантации.Белок сильно выражен в эпителиальных и железистых клетках. Костный морфогенный белок 2 (BMP2), член суперсемейства TGF-β, сначала обнаруживается в строме, окружающей место прикрепления бластоцисты во время средней секреторной фазы. BMP2 считается критическим регулятором децидуализации из-за его роли в регулировании пролиферации и дифференцировки, а также его экспрессии во время периода имплантации [13].

Амниотическая жидкость содержит значительное количество пролактина (ПРЛ), который вырабатывается децидуальной оболочкой.Было установлено, что производство ПРЛ эндометрием начинается примерно на 22-й день цикла, и его уровни повышаются на протяжении всей беременности. Точно так же высокие уровни IGFBP-1 и LEFTY2 вырабатываются эндометрием секреторной фазы в ответ на прогестерон. Учитывая их обилие и выработку во время менструального цикла, эти белки служат потенциальными маркерами рецептивности эндометрия, хотя клиническая польза еще не ясна [1-4,9].

Простагландины (PG), как было показано, играют решающую роль для успешной имплантации эмбриона из-за их вазоактивных свойств.Генерация PG достигается цитозольной фосфолипазой A ₂ (cPL) и циклооксигеназой (COX). Исследования на самках мышей, лишенных ферментов cPLA ₂ или COX-2, продемонстрировали жизненно важную роль PG в имплантации. Экспрессия PGE ₂ и PGF _2α была обнаружена в эндометрии человека на всех стадиях менструального цикла, но подавлялась во время поздней секреторной фазы [11].

Некоторые интегрины были сфокусированы на возможных маркерах рецептивности матки, и было отмечено, что они претерпевают изменения в эпителии и децидуальной оболочке во время имплантации.Совместная экспрессия α1β1, ανβ3 и α4β1 отмечает период восприимчивости эндометрия, опосредуя прочное прикрепление между эмбрионом и эндометрием. Регулируемая экспрессия интегринов секреторной фазы предполагает, что стероидные гормоны, вероятно, играют роль в их присутствии. Обнаружение экспрессии α1β1 / рецептора ламинина (VLA-1) на секреторной фазе эпителия эндометрия позволяет предположить, что прогестерон активирует α1β1 в эндометрии. Прочное прикрепление, опосредованное интегринами, также зависит от лигандов, связанных с интегрином.Секретируемый фосфопротеин 1 (SPP1), также известный как остеопонтин, является лигандом для ανβ3, который показал значительную повышающую регуляцию в эпителиальных клетках эндометрия во время секреторной фазы. Этот гликопротеин опосредует клеточную адгезию и миграцию во время имплантации эмбриона. Кальцитонин, известный активатор ανβ3, временно продуцируется в эпителии матки в период имплантации. Он функционирует, чтобы способствовать росту трофобластов на эпителиальных клетках эндометрия человека и подавляет экспрессию E-кадгерина [11,14].

Другой гликопротеин, обнаруженный в эндометрии человека, — это муцин-1 (MUC1), фактор, который препятствует клеточной адгезии, когда он сильно экспрессируется на поверхности клетки. MUC1, вероятно, первая молекула, которую эмбрион встречает на пути прикрепления, и считается, что она отталкивает бластоцисту до тех пор, пока время и место не станут идеальными для имплантации. Это подтверждается явным подавлением MUC1 прогестероном перед имплантацией в рецептивный эндометрий мышей.Сниженная экспрессия облегчает эмбрио-эпителиальные взаимодействия, демаскируя молекулы клеточной адгезии на поверхности эндометрия [11]. При измерении на людях MUC1 показал повышенную экспрессию во время периимплантационного периода, что противоречит исследованиям на других видах.

Два связанных с цитоскелетом белка, stathmin 1 и аннексин A2, наблюдали противоположную регуляцию рецептивного и пре-рецептивного эндометрия. Stathmin 1 представляет собой фосфопротеин и регулирует динамику микротрубочек во время прогрессирования клеточного цикла, особенно в месте имплантации эмбриона.В рецептивном эндометрии человека он подавлен из-за более низких уровней, необходимых для поддержки децидуализации. Аннексин А2, недавно идентифицированный как одна из молекул апикальной поверхности в рецептивном эндометрии человека, участвует в клеточной трансформации, дифференцировке, регуляции секреторных процессов, высвобождении пролактина и образовании простагландина. В эпителии эндометрия человека экспрессия аннексина А2 высока в средней и поздней секреторной фазе и снижается в пре-рецептивной фазе.Этот паттерн экспрессии, наряду с исследованиями in vitro, показывающими роль в адгезии эмбрионов, предполагает, что аннексин А2 жизненно важен для имплантации [15].

Биомаркер-репрессор генов, BCL6, измеряется для выявления эндометриоза у женщин с бесплодием, не имеющим другого объяснения. Экспрессия этого белка связана с воспалением, и значительно повышенные значения наблюдаются в секреторной фазе у пациентов с эндометриозом. Данные предполагают, что BCL6 связан с дисфункцией эндометрия, в первую очередь с резистентностью к прогестерону, что приводит к дефектам имплантации и увеличению количества неудач ЭКО [16,17].

Ионные каналы в эндометрии продемонстрировали роль в регулировании восприимчивости эндометрия и имплантации эмбриона. Объем электролитосодержащей жидкости в просвете матки колеблется на протяжении менструального цикла под влиянием гормонов яичников и значительно снижается в середине секреторной фазы. Это указывает на чистую абсорбцию жидкости через эндометрий во время рецептивной фазы. Регулятор трансмембранной проводимости при муковисцидозе (CFTR) опосредует отток Cl ^— , который необходим для секреции эпителиальной жидкости.Известно, что эпителий эндометрия содержит CFTR, играющий активную роль в эндометриальном Cl ^— и секреции жидкости. Снижение регуляции CFTR прогестероном во время секреторной фазы, вероятно, способствует уменьшению объема, что способствует имплантации эмбриона. Эпителиальный натриевый канал (ENaC) присутствует в эндометрии и обеспечивает движущую силу для абсорбции воды после установления градиента натрия, способствуя динамической регуляции жидкости в просвете матки.CFTR оказывает ингибирующее действие на ENaC, поэтому подавление CFTR во время секреторной фазы увеличивает абсорбционную активность эпителия эндометрия. ENaC активируется прогестероном, способствуя абсорбционным свойствам эпителия эндометрия во время секреторной фазы. Другие ионные каналы, такие как K ⁺ и Ca ²⁺ и переносчики ионов, SLC4 и SLC26, становятся важными игроками в регулировании определенных процессов имплантации эмбриона [13].

Микроматричный анализ ткани эндометрия позволяет одновременно оценивать от сотен до тысяч молекул.Геномный и протеомный анализ выявил различные уровни генов и белков, участвующих в широком спектре активности во время децидуализации. Оценка секретируемых жидкостей, называемая секретомикой, которая в основном изучает уровни белков и липидов, позволяет проводить высокопроизводительный анализ секретов эндометрия во время секреторной фазы без необходимости биопсии. Хотя наше понимание технологии микроматриц в отношении бесплодия все еще развивается, на рынке есть продукты, которые находят клиническое применение и будут обсуждаться более подробно позже в главе [3,18,19].

Эндометрий человека имеет уникальную протеомную подпись во время секреторной фазы, подтвержденную многими исследованиями. Маркеры восприимчивости измеряются в клинических условиях, чтобы избежать неудачной имплантации и, как мы надеемся, обеспечить более благоприятный исход для пациентов, получающих АРТ. Хотя некоторые из упомянутых биомаркеров только недавно были обнаружены в качестве ключевых игроков в рецептивном эндометрии человека, эти открытия показывают многообещающие перспективы для лучшего понимания сложных взаимодействий на протяжении секреторной фазы и окна имплантации.

Учитывая сложную природу восприимчивости эндометрия, неудивительно, что возникают проблемы. Местные факторы, которые могут отрицательно повлиять на восприимчивость и имплантацию, в широком смысле можно разделить на механические и воспалительные факторы. Местные факторы включают воспалительные состояния, такие как эндометриоз, аденомиоз, гидросальпинг и эндометрит, а механические аномалии включают как врожденные аномалии, так и приобретенные состояния [2,20,21].

Механические аномалии матки, такие как перегородки матки, миома, полипы и спайки, создают физические препятствия для успешного оплодотворения и имплантации.Эти состояния связаны с повторяющейся потерей беременности и бесплодием, и существуют веские доказательства того, что хирургическая коррекция этих аномалий может улучшить исходы [2,21].

Учитывая тонкую регуляцию менструального цикла и биологии имплантации, воспалительные факторы, влияющие на сигнальные пути, могут явно нарушить нормальные физиологические процессы. В условиях местного воспаления резистентность к прогестерону и преобладание рецепторов эстрогена были продемонстрированы с помощью анализа микрочипов, что приводит к нарушению имплантации.Например, при эндометриозе наблюдается увеличение воспалительных цитокинов, включая TNFα, INFγ, IL-1 и IL-17. Это приводит к последующим эффектам, таким как фосфорилированный STAT3, который, в свою очередь, помогает вести к состоянию с доминированием эстрогена и резистентностью к прогестерону [2,20]. Снижение экспрессии IL-11 и CCL4, которые связаны с восприимчивостью эмбриона, обнаруживается при хроническом эндометрите и, как полагают, связано с бесплодием, связанным с этим состоянием [22]. Низкий уровень интегрина был связан с воспалительными состояниями и сниженной экспрессией ανβ3, что может быть вызвано повышенным уровнем эстрогена и было связано с неудачей ЭКО.И наоборот, сверхэкспрессия ароматазы наблюдается при воспалительных состояниях и связана с прогнозированием неудач в циклах АРТ. Другие хемокины и цитокины, такие как интерлейкины, аналогичным образом связаны с воспалением и срывом беременности [2].

Хотя в нашем понимании рецептивности эндометрия и имплантации на уровне матки все еще существует множество пробелов, беременность и неудачи АРТ не могут быть полностью объяснены местными факторами. Существует множество системных заболеваний, которые могут влиять на среду матки и способность эмбриона к имплантации.Эти факторы включают заболевания щитовидной железы, дефицит витамина D, нарушения пролактина, воспалительные заболевания кишечника, ожирение и курение. Существуют достоверные данные о гипотиреозе и успешности бесплодия / ЭКО, побуждающие к лечению левотироксином у пациентов с ТТГ <2,5 мМЕ / л [2]. Ожирение аналогично связано с бесплодием, и имеются доказательства, подтверждающие снижение веса и улучшение показателей беременности [2,23]. Однако наше понимание того, как эти системные состояния влияют на фертильность, все еще ограничено, и необходимы дальнейшие исследования для полной оценки этих отношений.

Исторически датирование рецептивного эндометрия в основном основывалось на морфологических критериях [5]. Недостатки этого метода, вызванные значительным прогрессом в нашем молекулярном понимании эндометриального цикла, привели к появлению новых технологий. Хотя использование отдельных молекулярных сигнатур не дало удовлетворительных результатов, высокопроизводительный анализ широкого спектра маркеров был более многообещающим [3]. Недавнее создание «-омики» или областей, в которых используются высокопроизводительные методы со сложным анализом больших данных для создания гораздо более подробных изображений молекулярных и биохимических процессов, произвело революцию в нашем понимании рецептивного эндометрия [3,4,18, 19].

Анализ цикла эндометрия с использованием транскриптомики или изучение транскрипции ДНК в различных средах интенсивно исследуется уже более десяти лет [3]. Используя методы экспрессии генов на микрочипах, исследователи смогли изучить экспрессию тысяч генов одновременно на разных фазах цикла эндометрия. Они определили уникальный профиль гена во время периода имплантации, который включает важные факторы, ранее идентифицированные, такие как фактор ингибирования лейкемии (LIF), остеопонтин, CXCL14, гликоделин, IL15, лиганды L-селектина и различные антиоксиданты [3].Используя эту подпись транскрипции, Díaz-Gimeno et al. [24] создали клинический инструмент для определения восприимчивости эндометрия. В контролируемых исследованиях использование этого инструмента, получившего название «Матрица рецептивности эндометрия» (ERA), выявило сдвинутые окна имплантации у женщин с бесплодием. Кроме того, перенос эмбрионов во время соответствующего периода показал частоту наступления беременности и имплантации, аналогичную контрольной группе [25].

Хотя транскриптомика дала впечатляющие результаты, она основана на биопсии ткани.Исследователи анализировали состав эндометриальной жидкости, начиная с 1970-х годов [21]. В последнее время технологии позволяют проводить высокопроизводительный анализ вагинального секрета. Эта область исследований получила название секретомики [26,27]. Поскольку он фокусируется на отборе образцов внеклеточной жидкости, представляющие интерес молекулы в основном являются белками и липидами. Анализ белков в значительной степени выявил повышенные уровни белков, описанные другими методами. Однако постулируется, что травма от простого введения катетера для получения образца коррелирует с повышенным уровнем структурных белков [18].Анализ уровней липидов выявил повышенные уровни PGE2 и PGF2α во время WOI. Хотя предварительная информация об анализе секрета эндометрия интригует, необходимы дальнейшие исследования [18,27].

Наше понимание бесплодия и восприимчивости эндометрия значительно изменилось за последние несколько десятилетий. Однако многие вопросы остаются без ответа. Продолжается обнаружение новой информации о молекулярных и биохимических маркерах эндометриального цикла.Сюда входят потенциальные цели для фармацевтических препаратов. Эти открытия подпитываются значительным прогрессом в исследовательских технологиях. Высокопроизводительный анализ произвел революцию в этой области. Секвенирование следующего поколения или массовое параллельное секвенирование позволит еще более детально изучить уникальную сигнатуру рецептивного эндометрия. Перевод этого исследования в клинические испытания, а затем в клиническую практику окажет большое влияние на репродуктивную эндокринологию и бесплодие.

1. Critchley HO, Saunders PT (2009) Динамика рецепторов гормонов в восприимчивом эндометрии человека. Reprod Sci 16: 191-199. [Crossref]
2. Fox C, Morin S, Jeong JW, Scott RT Jr, Lessey BA (2016) Местные и системные факторы и имплантация: каковы доказательства? Fertil Steril 105: 873-884. [Crossref]
3. Гомес Э., Руис-Алонсо М., Миравет Дж., Симон С. (2015) Транскриптомика эндометрия человека: последствия для эмбриональной имплантации. Cold Spring Harb Perspect Med 5: a022996. [Crossref]
4. Gellersen B, Brosens JJ (2014) Циклическая децидуализация эндометрия человека в репродуктивном здоровье и отказе. Endocr Ред. 35: 851-905. [Crossref]
5. Noyes RW, Hertig AT, Rock J (1950) Датирование биопсии эндометрия. Fertil Steril 1: 3-25.
6. Rock J, Bartlett MK (1937) Исследования биопсии эндометрия человека: критерии датирования и информация об аменорее, меноррагии и времени овуляции. J Am Med Assoc 108: 2022-2028. [Crossref]
7. Bazer FW, Spencer TE, Johnson GA, Burghardt RC, Wu G (2009) Сравнительные аспекты имплантации. Репродукция 138: 195-209. [Crossref]
8. Wilcox AJ, Baird DD, Weinberg CR (1999) Время имплантации концепта и потеря беременности. N Engl J Med 340: 1796-1799. [Crossref]
9. Bazer FW, Wu G, Spencer TE, Johnson GA, Burghardt RC, et al. (2010) Новые способы имплантации, установления и сохранения беременности у млекопитающих. Mol Hum Reprod 16: 135-152. [Crossref]
10. Ариас-Стелла Дж. (2002) Реакция Ариаса-Стеллы: факты и фантазии четыре десятилетия спустя. Adv Anat Pathol 9: 12-23. [Crossref]
11. Achache H, Revel A (2006) Маркеры рецептивности эндометрия, путь к успешной имплантации эмбриона. Обновление Hum Reprod 12: 731-746. [Crossref]
12. Гарридо-Гомес Т., Киньонеро А., Антунес О, Диас-Гимено П., Беллвер Дж. И др. (2014) Расшифровка протеомной сигнатуры восприимчивости эндометрия человека. Hum Reprod 29: 1957-1967. [Crossref]
13. Ruan YC, Chen H, Chan HC (2014) Ионные каналы в эндометрии: регуляция рецептивности эндометрия и имплантация эмбриона. Обновление Hum Reprod 20: 517-529. [Crossref]
14. Lessey BA (1998) Интегрины эндометрия и установление восприимчивости матки. Hum Reprod 13 Suppl 3: 247-258. [Crossref]
15. Dominguez F, Garrido-Gomez T, Lopez JA, Camafeita E, Quinonero A, et al. (2009) Протеомный анализ восприимчивого и невосприимчивого эндометрия человека с использованием дифференциального электрофореза в геле и MALDI-MS показывает, что статмин 1 и аннексин А2 регулируются по-разному. Hum Reprod 24: 2607-2617. [Crossref]
16. Evans-Hoeker E, Lessey BA, Jeong JW, Savaris RF, Palomino WA, et al. (2016) Сверхэкспрессия BCL6 эндометрия в эутопическом эндометрии у женщин с эндометриозом. Reprod Sci 23: 1234-1241. [Crossref]
17. Miravet-Valenciano JA, Rincon-Bertolin A, Vilella F, Simon C (2015) Понимание и улучшение восприимчивости эндометрия. Curr Opin Obstet Gynecol 27: 187-192. [Crossref]
18. Berlanga O, Bradshaw HB, Vilella-Mitjana F, Garrido-Gómez T, Simón C (2011) Как секретомика эндометрия может помочь в прогнозировании имплантации. Плацента 3: S271-S275. [Crossref]
19. Диас-Химено П., Руис-Алонсо М., Блеса Д., Симон С. (2014) Транскриптомика эндометрия человека. Int J Dev Biol 58: 127-137. [Crossref]
20. Ahn SH, Singh V, Tayade C (2017) Биомаркеры эндометриоза: проблемы и возможности. Fertil Steril 107: 523-532. [Crossref]
21. Revel A (2012) Нарушение рецептивности эндометрия. Fertil Steril 97: 1028-1032. [Crossref]
22. Кита К., Мацубаяси Х., Ямагути К., Нишияма Р. и др.(2016) Хронический эндометрит: потенциальная причина бесплодия, акушерских и неонатальных осложнений. Am J Reprod Immunol 75: 13-22. [Crossref]
23. Marsh CA, Hecker E2 (2014) Материнское ожирение и неблагоприятные репродуктивные последствия: снижение риска. Obstet Gynecol Surv 69: 622-628. [Crossref]
24. Wolf DP, Mastroianni L Jr (1975) Белковый состав маточной жидкости человека. Fertil Steril 26: 240-247. [Crossref]
25. Диас-Химено П., Хоркахадас Дж. А., Мартинес-Конехеро Дж. А., Эстебан Ф. Дж., Алама П. и др.(2011) Инструмент геномной диагностики восприимчивости эндометрия человека на основе транскриптомной подписи. Fertil Steril 95: 50-60,60.e1-15. [Crossref]
26. Hood BL, Liu B, Alkhas A, Shoji Y, Challa R и др. (2015) Протеомика железистого эпителия и стромы эндометрия человека из пролиферативной и секреторной фаз менструального цикла. Biol Reprod 92: 106. [Crossref]
27. Cheong Y, Boomsma C, Heijnen C, Macklon N (2013) Секретомика матки: окно на интерфейсе матери и эмбриона. Fertil Steril 99: 1093-1099. [Crossref]

Томатосфера — Томатосфера | Специализированные клетки листовой системы

Изображение вверху: диаграмма, показывающая особые типы клеток, присутствующих в листьях

Без листьев на Земле не было бы жизни. Размер листа может варьироваться от крошечного листа обыкновенного водяного папоротника ( Azolla filiculoides), длиной всего один мм, до самых больших листьев пальмы рафии ( Raphia regalis ) длиной 25 метров.Независимо от размера, большинство листьев адаптировано для фотосинтеза . Это очень важный процесс, в котором растения превращают световую энергию в сахар и кислород. Чтобы узнать больше о фотосинтезе, см. Свет и растения.

Структура листа

Листья представляют собой сложные органы, состоящие из многих различных типов клеток (см. Рис. 1), включая эпидермис, слой мезофилла палисадного дерева, слой губчатого мезофилла и сосудистые пучки.

Рисунок 1: Поперечное сечение листа двудольного дерева, показывающее его различные ткани и анатомию.

Источник: Давайте поговорим о науке

1. Эпидермис — это «кожица» листьев. Листья имеют верхний эпидермис , , который расположен в верхней части листа. Кутикула также может иногда присутствовать на внешней стороне эпидермиса. Этот восковой слой помогает предотвратить потерю воды, особенно в засушливых регионах.
2. Слой мезофилла палисада состоит из плотно упакованных удлиненных клеток, расположенных чуть ниже верхнего эпидермиса.Они содержат хлоропластов, и осуществляют большую часть фотосинтеза.
3. Сосудистые пучки состоят из клеток ксилемы и клеток флоэмы . Это клетки, которые переносят воду и питательные вещества по всему растению и выглядят как прожилки на листьях.
4. Слой губчатого мезофилла расположен непосредственно под слоем палисадного мезофилла. Он состоит из ячеек неправильной формы, которые неплотно заполнены воздушными пространствами между .Клетки в губчатом слое обычно содержат мало хлоропластов (особенно у двудольных растений ) и являются местом хранения продуктов фотосинтеза. Все воздушные пространства связаны между собой и ведут к наружной стороне листа через устьица .
5. нижний эпидермис расположен на нижней стороне листьев. Устьицы обычно находятся на нижнем эпидермисе. Чтобы свести к минимуму транспирацию , которая происходит с газообменом, большинство двудольных растений имеют устьица на нижнем эпидермисе.С другой стороны, однодольных растений , таких как кукуруза, могут иметь устьица как на верхней, так и на нижней стороне листьев. Это связано с тем, что листья кукурузы растут вертикально, а не параллельно земле, и поэтому как верхняя, так и нижняя поверхности листьев испытывают испарение.

Хлоропласты и фотосинтез

Внутри хлоропластов находятся связанные с мембраной структуры, называемые тилакоидами , которые окружены стромой (см. Рисунок 2).

Рисунок 2: Схема хлоропласта и его структура.

Источник: Давайте поговорим о науке

Тилакоидные диски часто складываются в стопки, называемые грана . Грана соединены между собой тилакоидами стромы, также называемыми ламеллами , . Тилакоидная мембрана содержит хлорофилла , который улавливает энергию солнца, а также другие белковые комплексы, необходимые для фотосинтеза. Молекулы хлорофилла отражают зеленый свет, поэтому листья кажутся нам зелеными.Чтобы узнать больше о хлорофилле, см. Роль пигментов в растениях.

Обмен устьиц и газов

Устьица или поры на поверхности листа окружены специализированными клетками листа, называемыми замыкающими клетками (см. Рис. 3). Сторожевые клетки регулируют открытие и закрытие устьиц. Устьица пропускают кислорода и углекислый газ либо внутрь растения, либо покидают его. Водяной пар также покидает растение через устьица; с помощью процесса, известного как транспирация.

Рисунок 3: Схемы открытых (слева) и закрытых (справа) устьиц.

Источник: Давайте поговорим о науке

Как регулируется открытие и закрытие устьиц?

Каждая замыкающая клетка содержит большую вакуоль , а также ядро ​​, хлоропласты и другие типичные компоненты растительных клеток. Обычно, когда растение чувствует благоприятные условия, такие как высокая освещенность или высокая влажность, устьица открываются. Каналы в стенках замыкающих ячеек открываются для высвобождения протонов из ячеек, в то время как другие каналы позволяют проникать ионам калия .Это вызывает диффузию воды посредством осмоса в замыкающие клетки, заставляя их набухать и открывать поры. Обратный процесс происходит при закрытии устьиц из-за неблагоприятных условий.

Глоссарий

Воздушных пространств:

Пространство между клетками губчатого мезофилла, где происходит газообмен.

Двуокись углерода:

Газ, используемый растениями для фотосинтеза; газ, выделяемый животными в процессе клеточного дыхания. Растения также производят углекислый газ посредством клеточного дыхания, но они используют больше во время фотосинтеза, чем во время клеточного дыхания.

Хлорофилл:

Класс пигментов, производимых растениями, придающих растениям зеленый цвет. К ним относятся хлорофиллы а и b.

Хлоропласт:

Органелла, обнаруженная в растениях и некоторых водорослях, где происходит фотосинтез.

Кутикула:

Восковый слой обычно присутствует на внешней стороне эпидермиса у растений.

Двусторонняя:

Группа цветковых растений. Семена этой группы растений содержат два семенных листа.

Эпидермис:

Один слой клеток, покрывающий все части растения. Листья растений содержат верхний эпидермис, расположенный на верхней стороне листа, и нижний эпидермис, расположенный на нижней стороне листа.

Grana (единственное зерно):

Стопка тилакоидных дисков, напоминающая стопку монет или блинов.

Сторожевых камер:

Специализированные клетки, окружающие устьица, которые также контролируют открытие и закрытие устьиц.

Ламели:

Соедините стопки граны вместе.

Однодольные:

Группа цветковых растений. Семена этой группы растений содержат один семенной лист.

Ядро:

Органелла, которая хранит наследственную информацию в клетке и координирует деятельность клетки.

Осмос:

Движение молекул через полупроницаемую мембрану из области с более высокой концентрацией в область с более низкой концентрацией для выравнивания концентрации с обеих сторон мембраны.

Кислород:

Газ, используемый животными при дыхании; газ, вырабатываемый растениями во время фотосинтеза.

Палисадный слой мезофилла:

Плотно упакованный слой удлиненных клеток, расположенный непосредственно под верхним эпидермисом. Эти клетки содержат большую часть хлоропластов листа.

Флоэма:

Специализированные клетки в сосудистых пучках, которые переносят питательные вещества по всему растению.

Фотосинтез:

Процесс, используемый растениями для преобразования световой энергии в биохимическую энергию (сахар). Световая энергия используется для химического превращения углекислого газа и воды в кислород и сахар.

Калий:

Основной ион, присутствующий внутри клеток.

Протонов:

Положительно заряженные частицы, которые находятся в ядре каждого атома.

Дыхание:

Процесс, используемый растениями и животными для получения энергии из молекул сахара. При дыхании кислород и сахар химически превращаются в углекислый газ, воду и тепло.

Слой губчатого мезофилла:

Рыхлый слой ячеек неправильной формы. Воздушные пространства, окружающие этот слой ячеек, позволяют происходить газообмену.

Устьица (единственная стома):

Мелкие поры (дырочки), расположенные на листьях. Обычно они присутствуют на нижней стороне листьев, но их также можно найти и на верхней стороне.

Строма:

Жидкость, окружающая грану внутри хлоропластов.

Тилакоидов:

Мембранно-связанная структура в хлоропласте. Тилакоиды состоят из тилакоидной мембраны, окружающей тилакоидное пространство или просвет. Тилакоиды содержат хлорофилл и являются местом фотосинтеза.

Транспирация:

Процесс движения воды через растения и, в конечном итоге, испарение из мелких пор или устьиц в листьях.

Вакуоль:

Органелла, хранящая пищу, питательные вещества или отходы клетки.

Сосудистых пучков:

Нити сосудистых тканей, соединяющие все части растений, чтобы транспортировать питательные вещества и воду через флоэму и ксилему.

Водяной пар:

Молекулы воды в виде газа.

Ксилем:

Специализированные клетки в сосудистых пучках, которые переносят воду по всему растению.

Список литературы

Внешние ресурсы

• Measuring Stomatal Density (последнее посещение — 4 августа 2016 г.). В этой статье из журнала Science & Plants for Schools описывается деятельность по изучению устьиц, включая пилинг эпидермиса.

Пористый гидрогель на основе коллагена и метод имплантации для регенерации стромы роговицы и устойчивой местной доставки лекарств

Изготовление гидрогелей биоинженерного коллагена свиньи (BPC)

Ранее мы сообщали о производстве биоинженерных имплантатов роговицы с использованием свиного коллагена ^{14, 15} .Мы также сообщили о методе изготовления плоских имплантатов BPC толщиной 100 мкм ¹² . Здесь мы сообщаем об имплантатах, изготовленных из высокочистого свиного коллагена медицинского качества (ателоколлаген I типа), сшитого 1- [3- (диметиламино) пропил] -3-этилкарбодиимидом (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS). ). Водорастворимые сшивающие агенты нулевой длины EDC и NHS добавляли к 18% раствору коллагена и после смешивания полученного раствора использовали метод компрессионного формования. Для этого исследования были подготовлены изогнутые имплантаты заданной толщины, причем конечные гидрогели имели толщину 280 мкм и 440 мкм.Более тонкие гели были разработаны для интрастромальной имплантации, тогда как более толстые версии должны были использоваться для ALK. Для изготовления имплантатов использовали разные формы для каждой толщины, причем все формы имели форму изогнутых контактных линз для имитации кривизны роговицы.

Микроструктура поверхности и оптическая характеристика гидрогелей BPC

Для характеристики морфологии поверхности гидрогели BPC удаляли из раствора PBS, немедленно замораживали до -80 ° C в течение ночи и лиофилизировали в течение 5-6 часов.Затем имплантаты фиксировали для анализа с помощью сканирующей электронной микроскопии (SEM) на держателе образцов и покрывали распылением золотыми слоями в течение 60 с при давлении вакуума 0,1 бар. Изображения SEM были получены при разном увеличении (SEM Model S-2250 N; Hitachi). Измерения оптического пропускания проводились с использованием гидратированных имплантатов, погруженных в PBS при комнатной температуре. Светопропускание роговицы измеряли во всем диапазоне УФ и видимого спектра света от 200 до 700 нм при комнатной температуре с использованием спектрофотометра High Performance USB4000 UV-Vis.Толстые гидрогели (например, толщиной 500 мкм) использовали для измерений светопропускания, чтобы можно было сравнить их с роговицей человека.

Биосовместимость БПК с эпителиальными клетками роговицы человека

Все коллекции тканей соответствовали требованиям Хельсинкской декларации. Эпителиальные клетки роговицы человека (HCEC), взятые из роговицы донора человека, были получены из банка глаз при Центре исследований глаза, Отделение офтальмологии, Университетская больница Осло (региональные комитеты по этике медицинских и медицинских исследований, этическое разрешение Норвегии No.РЭК 1.2007.1099). Первичные HCEC от двух разных доноров (ID 16188 и 16200) были подвергнуты биопсии и обработаны Dispase II (2,4 Ед / мл, Roche Diagnostics GMBH, Мангейм, Германия) в течение 10 минут при 37 ° C, заблокированы фетальной бычьей сывороткой (Sigma-Aldrich) и высевают на 6-луночные планшеты (Corning Inc.) и поддерживают в комплексной среде, содержащей среду DMEM / F12 (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, Массачусетс, США), 100 Ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 1,25 мкг / мл. амфотерицин B, 5% FBS, 2 нг / мл фактора роста эпидермиса человека, 5 мкг / мл инсулин-трансферрин-селенит натрия, 15 мкМ гидрокортизон, 0.5% диметилсульфоксид и 30 нг / мл холерного токсина A (все от Sigma Aldrich) в увлажненном инкубаторе с 5% CO ₂ при 37 ° C. После того, как клетки, выросшие из биоптатов, достигли слияния, их собирали и высевали на 96-луночные планшеты для культивирования клеток (1 × 105 клеток / лунку) поверх гидрогелей или на дно планшета (контроль). Среды для культивирования клеток меняли каждые 3 дня, и культивирование клеток продолжалось до 14 дней. После 14 дней инкубации (3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-дифенилтетразолий бромид) анализ МТТ (% жизнеспособности клеток) и анализ живой / мертвой жизнеспособности / цитотоксичности (Invitrogen) проводили в трех повторностях. .Процент жизнеспособных клеток определяли фотометрическими измерениями синего продукта формазана при 570 нм и рассчитывали как отношение поглощения выращенных BPC клеток к поглощению контрольных клеток, причем каждое поглощение корректировали считыванием холостого образца. Клетки, окрашенные на жизнеспособность в живых / мертвых, фотографировали с помощью микроскопа Nikon smz1500.

Ex-vivo Испытание швов

Перед имплантацией in vivo трепан диаметром 7,25 мм (вакуумный трепан для роговицы Barron, Katena Products Inc., Штат Нью-Джерси, США) был использован для вырезания круглых пуговиц из изогнутых имплантатов BPC толщиной 440 мкм, а трепан диаметром 7,00 мм использовался для вырезания круглых пуговиц из изогнутых имплантатов BPC толщиной 280 мкм. Для испытания наложения швов ex-vivo сшивание BPC было протестировано путем имплантации образцов толщиной 440 мкм в качестве трансплантата на всю толщину в целые энуклеированные глаза свиньи (полученные на местном мясоперерабатывающем заводе). После помещения свиного глаза в вакуумный держатель роговичную пуговицу на всю толщину удаляли из нативной роговицы трепанацией вручную.Затем имплантат BPC толщиной 440 мкм вшивали в ложе реципиента с использованием 8 прерывистых кольцевых нейлоновых швов 10-0, сохраняя при этом конструкцию гидратированной с использованием среды для хранения роговицы Optisol. Регистрировали количество наложенных швов и количество успешно уложенных узлов, разрыв биоматериала и деформацию ткани. Впоследствии микроструктура была исследована путем иссечения области, где BPC был пришит к роговице свиньи, с последующим визуализацией ткани с помощью SEM.

Подкожная имплантация

Трем крысам Вистар массой 150–200 г давали анальгетик (0.01 мг бупренорфина) путем внутрибрюшинной инъекции за день до операции и в дни 0, 1 и 2 после операции, чтобы минимизировать послеоперационный дискомфорт. Находясь под общей анестезией (кетамин 25 мг / мл, Pfizer и дексмедетомидина гидрохлорид 0,5 мг / мл, Orion Pharma), кожа крысы была выбрита на дорсальной боковой области и сделан парапозвоночный кожный разрез длиной 2 см. Затем путем тупого рассечения создавали подкожный карман, и в него помещали квадратный плоский гидрогель размером 1 см. Затем карман зашили тремя рассасывающимися нитями Викрил.Изображения были сделаны на 0, 3, 5, 7, 6 и 21 и 8 недель после операции, чтобы оценить заживление ран и признаки воспаления. Крыс умерщвляли через 8 недель и собирали ткань в месте имплантации для оценки степени деградации, фиброза ткани, инвазии лейкоцитов и неоваскуляризации. Крыс использовали после получения этического разрешения Совета по этике животных Линчёпинга (ID разрешения 585), и все эксперименты соответствовали Директиве ЕС 2010/63 / EU.

Животные и хирургические модели для кератопластики с помощью фемтосекундного лазера

После получения разрешения от комитета по этике исследований животных Линчёпинга (разрешение №108-12), 23 самцам новозеландских белых кроликов-альбиносов массой 3–3,5 кг оперировали роговицу. Эксперименты проводились в соответствии с Положением Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO) по использованию животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения. Животных анестезировали внутримышечной инъекцией 25 мг / кг кетамина (Ketalar 50 мг / мл; Parke-Davis, Taby, Швеция) и 5 ​​мг / кг ксилазина (Rompun 20 мг / мл; Bayer, Гетеборг, Швеция). Помимо общей анестезии, местные обезболивающие капли (глазные капли тетракаина гидрохлорида 1%, Chauvin Pharmaceuticals Ltd., Суррей, Великобритания) также вводили перед операцией.

Кролики были разделены на четыре группы, различающиеся по типу имплантата (либо естественная ткань роговицы кролика, называемая «аутотрансплантат», либо имплантаты BPC) и по методу хирургической имплантации (ALK или гибридный интрастромальный лоскут LASIK в сочетании с ALK, выполняемый под лоскутом, называемый «Лоскут-АЛК»). Три группы по 5 кроликов в каждой подверглись процедурам аутотрансплантата ALK, ALK-BPC и Flap-ALK, в то время как оставшаяся группа из 8 кроликов перенесла операцию Flap-ALK BPC.Все процедуры ALK-BPC завершались BPC толщиной 440 мкм, тогда как процедуры Flap-ALK BPC были внутристромальными и использовали BPC толщиной 280 мкм. Толщина BPC была больше, чем у удаленной ткани, чтобы компенсировать известное уменьшение толщины материала после имплантации из-за уменьшения набухания ¹² .

Для выполнения всех операций использовался фемтосекундный лазер Intralase iFS 150 кГц (Abbott Medical Optics, Калифорния, США). Правый глаз всех животных был прооперирован, а левый глаз остался нетронутым.Самая тонкая средняя толщина роговицы 370 мкм (определенная с помощью оптической когерентной томографии) использовалась для обеих операционных процедур с фемтосекундным лазером. В ALK с фемтосекундным лазером центральная стромальная пуговица нативной роговицы диаметром 7 мм и глубиной 280 мкм (включая эпителий) вырезалась лазером. Нижележащая задняя строма и эндотелий со средней толщиной 90 мкм остались нетронутыми. Нативная роговичная пуговица была удалена вручную и либо возвращена в прежнее положение (аутотрансплантат), либо заменена имплантатом BPC толщиной 440 мкм и диаметром 7 мм.Аутотрансплантаты были пришиты к окружающей ткани хозяина с помощью шести-восьми узловых нейлоновых швов 10-0, в то время как из-за риска высокого натяжения шва, разрывающего биоматериал, имплантаты BPC удерживались на месте тремя вышележащими матрасными швами 10-0, как это было сделано. ранее ⁹ . В гибридной процедуре Flap-ALK с фемтосекундным лазером лазер впервые был использован для создания поверхностного роговичного лоскута типа LASIK диаметром 8 мм и толщиной 100 мкм. После этого под лоскутом вырезали стромальную пуговицу роговицы диаметром 7 мм и толщиной 180 мкм.Строма и эндотелий задней части роговицы (толщиной около 90 мкм) под областью разреза остались нетронутыми. После завершения лазерных разрезов лоскут вручную отделили и подняли тупым хирургическим шпателем, а нижележащую роговичную пуговицу удалили с помощью хирургических щипцов. В группе аутотрансплантата эта роговичная пуговица была впоследствии помещена обратно в стромальное ложе, в то время как в группе BPC она была заменена имплантатом BPC толщиной 280 мкм и диаметром 7 мм. После нативной стромальной пуговицы или замены имплантата вышележащий лоскут закрывали над стромальной областью и прикрепляли к окружающей ткани с помощью трех-семи узловых швов 10-0, наложенных через лоскут и периферическую ткань хозяина (избегая наложения швов на биоматериал или пуговицу аутотрансплантата, лежащую под ней. заслонка).

Сразу после операции местно вводили комбинацию гидрокортизона и окситетрациклиновой мази (Terracortil с полимиксином B 5 мл; Orifarm AB, Стокгольм, Швеция), а роговицы покрывали вязкоэластиком гиалуроната натрия (Healon GV 14 мг / мл; AMO Uppsala) AB, Упсала, Швеция) для защиты открытых трансплантатов при процедурах ALK и для улучшения заживления эпителия на всех прооперированных роговицах. Обезболивающий препарат длительного действия (Temgesic 0,3 мг / мл, RB Pharmaceuticals Limited, Беркшир, Великобритания) вводился после операции путем внутримышечной инъекции всем кроликам каждые двенадцать часов в течение первых двух послеоперационных дней.

Капли стероид-антибиотик вводили три раза в день в первую послеоперационную неделю и продолжали или вводили повторно в зависимости от клинической оценки прооперированных глаз. В случаях сильной боли, которая влияла на общее состояние кроликов, также вводили обезболивающее. У всех кроликов через месяц после операции сняли швы.

Послеоперационная клиническая оценка

Оперированные глаза были исследованы клинически с помощью цифровой фотографии с большим увеличением (камера Nikon D90, Nikon Canada Inc., Торонто, Канада), оптической когерентной томографии переднего сегмента (AS-OCT; Visante OCT, Carl Zeiss AB, Стокгольм, Швеция) и конфокальной микроскопии in vivo (IVCM; Heidelberg Retinal Tomograph 3 with Rostock Corneal Module, Heidelberg Engineering, Heidelberg, Германия ). Обследования проводились сразу после операции и после операции через 1 неделю, 1, 3 и 6 месяцев. Кроме того, глаза были клинически исследованы на непрозрачность роговицы и неоваскуляризацию с использованием модифицированной системы оценки MacDonald-Shadduck ¹⁶ .Целостность эпителия прооперированных роговиц исследовали через неделю после операции с помощью теста на окрашивание глаз флуоресцеином.

Как описано ранее ^12,13 , AS-OCT использовалась для оценки толщины роговицы после операции, а также для визуализации лоскута и лежащих под ним имплантированных материалов. Средняя центральная толщина роговицы определялась автоматически с помощью встроенного программного обеспечения ОКТ. IVCM также была проведена для оценки морфологии имплантатов и всех слоев окружающей ткани роговицы хозяина в соответствии с более ранним протоколом ¹⁷ .Внимание также уделялось интерфейсам имплантата-хозяина для обнаружения возможного врастания клеток-хозяев и нервов в имплантированные области. Изображения IVCM, полученные через 6 месяцев после операции у всех животных, использовали для качественного и полуколичественного анализа.

Иммуногистохимия

После завершения имплантации роговицы кроликам (6 месяцев) роговицы вырезали и фиксировали в 4% растворе параформальдегида, заливали парафином, делали срезы толщиной 4 мкм и окрашивали гематоксилином и эозином (H&E).Срезы залитых парафином тканей депарафинизировали с помощью убывающих концентраций ксилола и этанола, трипсинизировали в течение 5 минут для извлечения антигена, а эндогенную пероксидазу нейтрализовали 3% перекисью водорода в метаноле. После блокирования с помощью бычьего сывороточного альбумина (BSA) 2,5% в течение 1 ч срезы инкубировали в течение ночи при 4 ° C со следующими первичными антителами: моноклональная α-SMA мыши (разведение 1:25, ab7817, Abcam, Cambridge, United Kingdom), моноклональный бета III тубулин мыши (разведение 1: 100, ab7751, Abcam), моноклональный коллаген III типа мыши (разведение 1: 100, Acris AF 5810, Германия) и моноклональный CD45 мыши (разведение 1:10, ab86080, Abcam) в 2 .5% BSA. Контрольные срезы инкубировали только с 2,5% BSA без добавления первичного антитела. Срезы промывали PBS-T и инкубировали с конъюгированным с HRP антителом IgG (AP308P, 2688593; 1: 1000; Merck Millipore, MA, США) в течение 1 ч при комнатной температуре. Связанную пероксидазу визуализировали, инкубируя срезы в течение 6 мин в растворе 0,1 М трис-HCl (TB; pH 7,4), содержащем 0,05% 3-3′-диаминобензидина (DAB, Sigma-Aldrich), 0,04% хлорида никеля и 0,0075% Н ₂ О ₂ . Реакцию останавливали несколькими промывками PBS-T.Затем образцы обезвоживали, очищали в ксилоле и закрывали покровное стекло, используя монтажную среду Mountex (Histolab Products AB, Гетеборг, Швеция). Световую микроскопию выполняли на микроскопе Axiophot Photomicroscope (Zeiss, Германия) при 10-кратном и 20-кратном увеличении.

После завершения подкожной имплантации крысам (8 недель) имплантаты с окружающими мягкими тканями были удалены и обработаны, как описано выше. Были использованы те же антитела, но были визуализированы с использованием вторичного антитела DyLight 488 (1: 1000, Thermo Fischer Scientific, Массачусетс, США) и установлены (антифадный реагент ProLong Gold с DAPI, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Массачусетс, США).Изображения были получены с помощью вертикального лазерного конфокального микроскопа LSM700 (Carl Zeiss, Оберкохен, Германия).

Тест высвобождения лекарственного средства in vitro

Для оценки возможности использования БПК в качестве резервуара, способствующего доставке лекарственного средства с замедленным высвобождением после имплантации, был проведен тест высвобождения лекарственного средства in vitro. Был приобретен рекомбинантный бета-фактор роста нервов крыс (NGF-β) (Sigma Aldrich, Стокгольм, Швеция), и исходный раствор с концентрацией 3,2% мас. / Об. Был приготовлен путем растворения порошка NGF-β в стерильном буферном растворе MES (2- (N -морфолино) этансульфоновая кислота).Раствор поддерживали при комнатной температуре, и 48 мкл вводили в исходный раствор коллагена во время изготовления имплантатов BPC. Во время изготовления и хранения имплантата образцы супернатанта среды хранения сохраняли и использовали для определения общего количества NGF-β в супернатанте, которое вычитали из начального количества, добавленного во время изготовления, для определения общей массы NGF- β в каждом имплантате BPC. Для теста медленного высвобождения шесть имплантатов (экспериментальные копии) инкубировали отдельно в 2 мл стерильного PBS и выдерживали при 37 ° C в течение 60 дней.Время отбора проб было следующим: 6 ч, 24 ч, 3д, 5д, 10д, 20д, 30д, 40д, 50д и 60д. В каждую точку отбора проб отбирали 200 мкл супернатанта и хранили при -20 ° C и заменяли 200 мкл свежего стерильного PBS. Через 60 дней все образцы оттаивали и анализировали с помощью ELISA (набор для ELISA Rat NGF-β, Sigma) в соответствии с инструкциями производителя. Последовательное разбавление исходного раствора NGF-β использовали для построения стандартной калибровочной кривой. Кумулятивный профиль высвобождения определяли в каждый момент времени как сумму общего NGF-β в общем объеме супернатанта (концентрация × общий объем) в настоящий момент и во все предыдущие моменты времени.Затем это кумулятивное высвобожденное количество выражали как процент от общей массы NGF-β, изначально присутствующей в каждом имплантате BPC.

Статистический анализ

Толщину роговицы через 6 месяцев в аутотрансплантате, имплантированном BPC и роговице нативного кролика сравнивали с помощью однофакторного дисперсионного анализа, примененного к методам ALK и Flap-ALK, с методом апостериорного сравнения Тьюки для выделения попарных различий. Непрозрачность роговицы и оценка неоваскуляризации роговицы, имплантированной аутотрансплантатом и BPC, через 6 месяцев сравнивались с помощью критерия суммы рангов Манна-Уитни.Все статистические анализы были выполнены с использованием SigmaStat версии 3.5 для Windows (Systat Software Inc., Чикаго, США). Двусторонний порог P <0,05 считался статистически значимым.

кросслинкинг роговицы при различных заболеваниях роговицы

кросслинкинг роговичного коллагена (CXL) — многообещающая разработка в рефракционной хирургии. CXL с рибофлавином — общепринятый метод лечения эктатических заболеваний роговицы; однако сообщалось об успешном применении CXL при буллезной кератопатии, расплавлении роговицы и инфекционных язвах роговицы.В этой статье дается краткий обзор использования CXL для каждого из этих показаний.

KERATOCONUS
Для оптимальной оптики роговицы требуется гладкая, ровная поверхность со здоровой слезной пленкой и эпителием. Для четкого зрения необходимо регулярное расположение стромальных клеток и макромолекул. Решетка коллагеновых фибрилл действует как дифракционная решетка, уменьшая рассеяние света за счет деструктивной интерференции. ¹ При кератоконусе расположение стромальных фибрилл теряется, количество коллагеновых пластинок уменьшается, и коллагеновые пучки разделяются. ^2,3

Кератоконус встречается относительно часто, с частотой один случай на 2000. Он часто поражает молодых пациентов, и нет никаких известных эффективных методов лечения, чтобы остановить прогрессирующий кератоконус. В конце концов, примерно 21% пациентов с кератоконусом нуждаются в трансплантации роговицы. ³ Целью CXL является устранение патогенных причин кератоконуса путем изменения внутренних биомеханических свойств коллагена роговицы. Дополнительные химические связи создаются внутри стромы; фотополимеризация происходит в передней строме с минимальным воздействием на окружающие структуры глаза. ⁴

Wollensak провел первое клиническое испытание CXL для лечения кератоконуса, ⁵ изучило 22 пациента, получавших рибофлавин и УФ-A. CXL немного изменил и сгладил кератоконус (2,00 D) у 72% и улучшил BCVA в 68%. В 70% глаз был достигнут регресс; Максимальные показания кератометрии (K) и погрешность рефракции снизились на 2,01 и 1,14 D соответственно. В отдельном исследовании Caporossi et al ⁶ показали, что среднее снижение калия составляет 2.10 Д.

Chan et al. ⁷ сообщили о первом исследовании, сочетающем использование Intacs (Addition Technology, Inc., Des Plaines, Illinois) с CXL, что привело к большему снижению явной рефракции, крутого значения K и среднего значения K. Средние изменения в UCVA, BCVA, сфере и средних значениях K составили 6,5 линии, 1 линию, 0,12 D и 1,34 D, соответственно, после Intacs с CXL. С одним только Intacs изменения составили 9,5 строк, 1 строку, 0,25 D и 0,21 D соответственно.

Эффективность кросслинкинга с удалением эпителия или без него также является спорной.Некоторые считают, что сохранение неповрежденного эпителия вызывает недостаточное проникновение рибофлавина, увеличивает проникновение УФ-А и приводит к возможному повреждению клеток. Тем не менее, Пинелли и др. Сообщили о результатах 6-месячного кросслинкинга и обнаружили сопоставимые результаты с эпителием и без него с точки зрения изменений кератометрии, зрения и количества эндотелиальных клеток. ⁸ Sharma и Boxer Wachler также сообщили о схожих результатах после кросслинкинга без удаления эпителия. ⁹ Кроме того, Podskochy et al. ¹⁰ показали повышенное повреждение кератоцитов УФ-А светом при удалении эпителия.Они предположили, что эпителий может играть важную роль в поглощении УФ-А и, таким образом, защищать роговицу и более глубокие структуры от повреждений.

Клинические исходы различаются после CXL плюс Intacs. Эта комбинация привела к более ровной топографии с визуальным улучшением. ¹¹ При развитом кератоконусе после имплантации Intacs можно рассмотреть возможность CXL, чтобы обеспечить небольшое улучшение рефракционных и визуальных результатов с возможной стабилизацией.

ЯЗВОВ Роговицы
В последнее время CXL используется для лечения расплавления роговицы и язв.Развитие язвы роговицы может быть катастрофическим последствием бактериальной, вирусной или грибковой инфекции. Даже если бактериальные токсины не обладают прямой коллагенолитической активностью, виды Pseudomonas продуцируют протеазу, способную разрушать гликозаминогликаны. ¹²

Независимо от причины расплавлению стромы обычно предшествует дефект эпителия роговицы; это связано с несоответствующей воспалительной реакцией. Известно, что изъязвление является вторичным по отношению к действию тканевых коллагеназ, которые выполняют начальное расщепление стромальных коллагеновых фибрилл с дальнейшей деградацией коллагена и гликозаминогликанов с участием протеаз, пептидаз и катепсинов.Инициирование распада тканевого коллагена потенциально может контролироваться на уровнях концентрации и активности коллагеназы клеточными и гуморальными активаторами и ингибиторами. ¹³

Клеточные компоненты, ответственные за изъязвление, и их взаимодействия являются предметом обширных исследовательских интересов. Несмотря на то, что имеются существенные доказательства причастности к действию и взаимодействию поврежденного эпителия роговицы и кератоцитов, другие патологические и экспериментальные исследования подчеркнули роль острых воспалительных клеток в образовании язв.Эти воспалительные клетки содержат более дюжины литических ферментов, таких как коллагеназа, эластаза и катепсин, в своих лизосомах и повсеместно встречаются в местах активных язв и в слезной пленке тающих конусов (рис. 1). ¹⁴

По сравнению с контролем Spoerl et al. ¹⁵ обнаружили впечатляющее удвоение времени переваривания после переваривания пепсина, трипсина и коллагеназы в роговицах, сшитых рибофлавином и УФ-А при 3 мВт / см². В этом исследовании 60 энуклеированных глаз свиней обрабатывали рибофлавином и УФ-А излучением (370 нм; интенсивность излучения 1–3 мВт / см²) в течение 30 минут и сравнивали с 20 необработанными контрольными глазами.После обработки CXL кнопки роговицы были трепаны и обработаны растворами пепсина, трипсина и коллагеназы. Фотохимический CXL роговицы с использованием рибофлавина и УФ-A привел к заметному увеличению устойчивости по сравнению с ферментами, переваривающими коллаген. Этот результат отражает биохимический эффект сшивающей обработки в дополнение к его уже известному биохимическому эффекту. ¹⁶ Стабилизирующий биохимический эффект сшивания можно объяснить изменениями третичной структуры фибрилл коллагена, вызванными сшиванием и предотвращением доступа протеолитических ферментов к их специфическим сайтам расщепления из-за стерических затруднений. ¹⁷

Таким образом, CXL в роговице значительно увеличивает устойчивость к перевариванию коллагеназы, пепсина и трипсина, особенно в передней половине роговицы. Это еще одно важное преимущество CXL в дополнение к увеличению биомеханической стабильности после этой процедуры.

СКЛЕРАЛЬНЫЙ CXL ПРИ ГЛАУКОМЕ, ПАТОЛОГИЧЕСКОЙ МИОПИИ
Прогрессирующая миопия, имеющая противоречивый патогенез, остается нерешенной проблемой в офтальмологии.Одной из важных особенностей тяжелой миопии является патологическое изменение биомеханически ослабленной склеры с прогрессирующим истончением, вероятно, из-за нарушенного механизма обратной связи эмметропизации после визуальной депривации. ¹⁸

При длине волны 465 нм 35% света поглощается склерой, 57% отражается, а пропускание неотраженного света составляет примерно 8%, поэтому этого достаточно для склеральной CXL. ¹⁹ Wollensak et al. ²⁰ изучали склеральный CXL в глазах живых кроликов с использованием рибофлавина и длины волны 365 нм при 4.2 мВт / см² для индукции CXL. Они измерили повышенный предельный стресс до 228%, а также обнаружили повреждение сетчатки с пигментным эпителием и фоторецепторами сетчатки, а также отмирание внешнего ядерного слоя при воздействии рибофлавина.

Iseli et al., ^21, обработали шести кроликов местным рибофлавином (0,5%) и синим светом (465 нм) на экваториальной склере, используя источник света на светодиодах с площадью экспонирования 9 мм. Через четыре недели после лечения произошло трехкратное увеличение жесткости на кривой напряжение-деформация.

Значения параметра «напряжение-деформация» и модуля Юнга склеры у людей с миопией были значительно ниже, чем у возрастной нормы. ²² Таким образом, было разработано несколько методов хирургической склеропластики для укрепления склеры, включая инъекции полимерной композиции, которая образует вспененный гель под теноновой капсулой и вызывает образование рубцовой ткани. Также были описаны операции по укреплению склеры, при которых донорская склера, широкая лицевая сторона или синтетические повязки помещаются вокруг задней поверхности глазного яблока и пришиваются к склере.Они уменьшают прогрессирование осевого удлинения; ^23,24 , однако, они не восстанавливают внутреннюю структуру и сшивающие свойства ослабленной склеры.

Головка миопического зрительного нерва более восприимчива к нескольким вероятным формам инсульта, связанного с внутриглазным давлением (ВГД), на всех уровнях ВГД. Миопический склеральный канал может быть необычно большим, аномальной формы и / или наклонным, что приводит к повышенным уровням стресса, связанного с ВГД, для данного уровня ВГД. ^25-27 Миопическая перипапиллярная склера и пластинка могут быть тонкими, что приводит к более высокому напряжению и деформации ламинарных и склеральных стенок, связанных с ВГД. ²⁸ Кроме того, внеклеточный матрикс миопического глаза может быть ненормально слабым, вызывая большие ламинарные деформации для данного уровня ВГД. Размер глаза с аксиальной миопией должен увеличивать склеральное напряжение, связанное с ВГД, для любого заданного уровня. ^25,28,29

Наличие нескольких клинических взаимосвязей подтверждает мнение о том, что глаз с аксиальной миопией более восприимчив как к нормальному, так и к повышенному уровню ВГД. Они могут быть связаны с перипапиллярной склерой и криброзной пластинкой, которые на самом деле тоньше у близоруких глаз, чем у хорошо подобранных нормальных глаз.

Мы знаем, что нарушение CXL является важным фактором в процессе ослабления миопической склеры. ³⁰ Wollensak et al. ³¹ продемонстрировали впечатляющий эффект жесткости CXL in vivo на склеру кролика после обработки глицеральдегидом в течение 14 дней. Биомеханические тесты показали, что предложенный метод армирования склеры значительно улучшил биомеханические параметры склеры. Может стать возможным совершенно новый склеральный подход к профилактике и лечению прогрессирующей миопии.Используя субтеноновые инъекции с большим объемом инъекции, должно быть возможно достичь лечебного эффекта на всей склере из-за легкого распространения вводимой жидкости в субтеноновом пространстве по всему земному шару. ^32,33 Однако метод UV-A позволяет проводить CXL в четко определенной целевой области склеры, что может быть преимуществом при таких заболеваниях, как миопическая склеральная стафилома. Кроме того, при облучении рибофлавином / УФ-А протяженность обрабатываемой области легко контролируется из-за видимой УФ-А — индуцированной светом флуоресценции на поверхности склеры. ³¹

В будущем, возможно, появится возможность лечить пациентов с прогрессирующей миопией, используя склеральный CXL с рибофлавином и синим светом на 465 нм.

БУЛОЧНАЯ КЕРАТОПАТИЯ
Без достаточной функции эндотелиального насоса роговица набухает, и жидкость накапливается во внеклеточных пространствах между коллагеновыми волокнами и пластинками. ³⁴ При отеке роговицы расстояние между волокнами коллагена увеличено из-за скопления жидкости.Концепция уплотнения стромы с повышенным сопротивлением накоплению осмотической и гидростатической жидкости представляет собой еще одно привлекательное применение техники CXL. Krueger et al. ³⁵ показали, что поэтапное CXL УФ-А (15 мВт / см²) с фемтосекундным лазерным интрастромальным введением 0,1% рибофлавина может быть безопасным и эффективным методом лечения буллезной кератопатии. Исследователи также представили концепцию постановки интрастромального введения рибофлавина через второй, более передний стромальный карман после достижения более глубокого CXL.В этом методе поверхностные слои также могут подвергаться уплотнению стромы и уменьшению скопления жидкости в передней части.

Способность постоянно укреплять изначально ослабленную роговицу обещает стать крупным достижением в офтальмологии. CXL — это простая, безопасная и эффективная процедура для лечения эктатических воспалительных заболеваний роговицы, а также таяния роговицы и буллезной кератопатии. В ближайшем будущем лечение CXL может стать стандартом лечения.

Айлин Килич Эртан, доктор медицинских наук, главный врач и руководитель отделения катарактальной и рефракционной хирургии, Глазная больница Кудрет, Анкара, Турция.Доктор Эртан заявляет, что у нее нет финансовой заинтересованности в упомянутых продуктах или компаниях. С ней можно связаться по тел .: +90 312 4466464; факс: +90 312 4464771; электронная почта: [email protected].

границ | Агрегация мезенхимальных стромальных клеток человека устраняет их способность подавлять Т-клетки человека

Введение

Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) десятилетиями использовались для лечения воспалительных заболеваний из-за их способности продуцировать ряд иммуносупрессивных продуктов.МСК продуцировали IDO (1), кинуренин (2), PGE2 (3, 4), CD73 (5, 6), TGF-β (7), IL-6 (8) и TSG-6 (9), среди других , позволяют МСК модулировать поведение Т-клеток, В-клеток, макрофагов, естественных клеток-киллеров, дендритных клеток и нейтрофилов (10). Способность МСК как ослаблять воспаление, так и способствовать развитию противовоспалительного толерогенного фенотипа у нескольких иммунных подгрупп сделала их кандидатами для лечения сложных воспалительных заболеваний, таких как болезнь трансплантат против хозяина, болезнь Крона, рассеянный склероз, астма, хронические раны и т. Д. ревматоидный артрит.

Подавляющее большинство методов оценки и скрининга активности МСК основаны на in vitro и адгезивных культурах МСК; однако это может не отражать их среду после трансплантации. В настоящее время около половины всех клинических испытаний с использованием МСК проводились с местными инъекциями МСК (11). Локальная доставка МСК размещает МСК рядом с местом повреждения или воспаления, устраняя при этом риск эмболизации, возникающей при системных инфузиях (12, 13). Однако, когда МСК вводят в пространственно ограниченный сайт, они, как известно, агрегируются с образованием сфероидов.Этот феномен агрегации наблюдался у грызунов после внутрибрюшинных (14), подкожных (15, 16) и внутрижелудочковых (17) инъекций, а изменения фенотипа МСК наблюдались при внутримышечных инъекциях (15), что побудило к изучению сфероидных МСК. фенотип. Хотя известно, что МСК в сфероидах резко изменяют экспрессию их генов при локальной инъекции (14), все последствия агрегации на взаимодействия МСК с Т-клетками неизвестны. Частое использование местных инъекций и свидетельства изменений транскрипции при агрегации МСК затрудняют использование анализов активности прикрепленных МСК для оценки продуктов МСК перед использованием в местных приложениях.

Изменения секретома изменяют взаимодействие МСК с иммунными клетками. На сегодняшний день исследования показали, что агрегация в сфероиды заставляет МСК активировать PGE2, TSG-6, IL-1α / β и STC1, а также несколько матричных факторов (14, 18, 19). В транслуночных экспериментах с иммортализованными макрофагами мыши человеческие сфероидные МСК снижали продукцию макрофагами ФНО-α и увеличивали ИЛ-10 больше, чем прикрепленные МСК (14, 18, 20). Подобные усиленные взаимодействия сфероидных МСК с популяциями макрофагов наблюдались с макрофагами, происходящими из THP-1, а также на модели перитонита у мышей (14, 18).На животных моделях было показано, что сфероидные МСК уменьшают спонтанную потерю конечностей на модели ишемии задних конечностей (21), уменьшают объем инфаркта в модели инсульта (22), спасают клетки почек от апоптоза (23) и способствуют увеличению костной ткани. регенерация (24), возможно, из-за повышенного уровня секреции фактора роста (25). Несмотря на то, что они оказываются полезными в нескольких условиях, полное влияние агрегации на иммуномодулирующий фенотип МСК не выявлено, что имеет решающее значение как для подавления воспаления, так и, в аллогенных применениях, для уклонения от иммунитета (26).

Многие из симптомов заболевания, при которых происходит локальная инъекция МСК, опосредованы привлечением Т-клеток и эффекторной функцией. Это связано с тем, что прикрепленные МСК сильно подавляют активированные Т-клетки, РВМС и смешанные реакции лимфоцитов (MLR) in vitro (1, 2, 27–30). Однако на сегодняшний день мало исследований посвящено изучению взаимодействия недифференцированных сфероидных МСК с Т-клетками. Чтобы перевести МСК в клинику, мы должны знать, обладают ли сфероидные МСК сравнимой иммуномодулирующей активностью с их прикрепленными аналогами или они демонстрируют совершенно другой, не обязательно лучший, иммуномодулирующий профиль.Если эти профили различны, не имеет смысла изучать активность MSC в условиях прилипания или использовать анализы активности прилипания для скрининга продуктов MSC, поскольку их поведение быстро меняется при местной инъекции.

Здесь мы стремимся выяснить влияние, которое агрегация оказывает на способность МСК подавлять Т-клетки в популяциях РВМС, чтобы более полно понять иммуномодулирующий фенотип сфероидных МСК. Понимание этих фенотипических изменений может быть использовано для обоснования логического дизайна и применения локализованных методов лечения МСК, отдельно или в сочетании с лекарствами для лечения воспалительных состояний.

Материалы и методы

Культура сфероидов МСК

В этом исследовании использовались МСК костного мозга человека и пуповины от шести доноров. МСК из костного мозга человека, охарактеризованные и полученные из RoosterBio (MSC-001 Lot: 00082, MSC-003 Lot: 00055 и MSC-003 Lot: 00022), были использованы в дополнение к донору, полученному из Техасского центра научных исследований здоровья A&M College of Медицинский институт регенеративной медицины в Scott & White благодаря гранту Офиса директора NIH, грант P40OD011050, идентификатор ресурса SCR_005522 (донор № 7083).МСК из пуповины были выделены и охарактеризованы в лаборатории (дополнительный рисунок 1). МСК культивировали в MEM-α (Fisher Scientific, № по каталогу BW12-169F) с добавлением 15% прослеживаемой фетальной бычьей сыворотки премиум-класса ISIA (VWR, № по каталогу 97068-085, лот № 059B18), 1% L-глутамина (Life Technologies , № по каталогу 25030081) и 1% пенициллин-стрептомицин (Life Technologies, № по каталогу 15140122). Клетки высевали с плотностью 4 000–6 000 клеток / см ² и выращивали до 70–90% конфлюэнтности. Для экспериментов 2D-адгезивные МСК (Adh) высевали при 5300 МСК / см ² в колбы Т-75 и инкубировали при 37 ° C в течение 3 дней.Прилипшие МСК диссоциировали с помощью аккутазы, подсчитывали и высевали в начале каждого эксперимента, чтобы гарантировать, что начальное количество МСК было сопоставимым как в прикрепленных, так и в сфероидных условиях. Сфероиды МСК (Sph) были сформированы с использованием техники висящих капель, как ранее описано Ylostalo и другие. (31). Вкратце, МСК ресуспендировали до 1 миллиона клеток / мл и 20 мкл капель клеточной суспензии помещали на крышки чашек Петри. Жертвенные капли среды помещали вокруг капель клеток, и к основанию чашки Петри добавляли PBS, чтобы минимизировать потери при испарении во время процесса образования сфероидов.Крышки переворачивали и инкубировали при 37 ° C в течение 3 дней. Подробное описание протокола изоляции пуповины приведено в дополнительных материалах и методах.

Прилипшая и сфероидная продукция МСК иммуномодулирующих факторов, таких как IDO, COX-2, CD73 и TGF-β, была проанализирована на уровне РНК, белка или ферментативного продукта. Подробные протоколы ОТ-ПЦР, вестерн-блоттинга, иммуногистохимии, ELISA и анализа активности ферментов представлены в дополнительных материалах и методах.

Совместное культивирование PBMC и Т-клеток с МСК Sph и Adh

изолированных PBMC или Т-клеток, как описано в дополнительных материалах и методах, окрашивали CSFE (Biolegend, № по каталогу 423801), как описано производителем. Вкратце, PBMC или Т-клетки размораживали и помещали в теплый полный RPMI, содержащий 10% прослеживаемого FBS высшего сорта ISIA, 1% пенициллина / стрептомицина и 1% L-глутамина, по крайней мере, на 1 час до процесса окрашивания. Клетки подсчитывали и ресуспендировали в PBS из расчета 1 миллион клеток / мл.Два микролитра 5 мМ CSFE в ДМСО на 10 миллионов PBMC или Т-клеток встряхивали в суспензии клеток для получения конечной концентрации красителя 1 мкМ. РВМС или Т-клетки инкубировали при 37 ° C в темноте в течение 15 мин. Затем CFSE нейтрализовали полной RPMI, центрифугировали при 500 g в течение 5 минут и ресуспендировали в полной RPMI. Затем клеткам давали инкубироваться в течение 30 минут при 37 ° C. Клетки центрифугировали и ресуспендировали при 2 млн клеток / мл в полной RPMI. РВМС или Т-клетки для нестимулированного контроля удаляли перед добавлением человеческого CD3 / CD28 Dynabead (Thermo Fisher, № по каталогу 11132D) и доводили до конечной концентрации 1 миллион клеток / мл.240 000 PBMC с Dynabeads или без них добавляли в соответствующие лунки 24-луночного планшета.

Прилипшие МСК или сфероиды высевали за 3 дня до совместного культивирования. Собирали адгезивные клетки, ресуспендировали до 1 миллиона клеток / мл, а затем высевали 60 000 MSC (~ 1: 4 MSC: PBMC). Три предварительно сформированных сфероида из 20 000 клеток затем переносили в лунки для получения равного количества сфероидных МСК с прикрепленными МСК в начале каждого эксперимента, если не указано иное. Для подтверждения точного количества сфероидов в каждой лунке использовалось визуальное подтверждение.После 6 дней совместного культивирования собирали PBMC или Т-клетки и анализировали их пролиферацию с помощью проточной цитометрии. CD3 / CD28 Dynabead-стимулированные и нестимулированные контрольные PBMC без МСК использовали для установки ворот пролиферации в каждом эксперименте. Все отрицательные контроли без стимуляции Dynabead не показали пролиферации. Пролиферация PBMC указывается либо как процент от общего количества PBMC, которые должны пролиферировать, либо нормализованная к стимулированному контролю с использованием формулы: (% образца пролиферации) / (% положительного контроля пролиферации).Дополнительный анализ поколений РВМС выполняли с использованием программного обеспечения FlowJo v10, а нормализованная пролиферация описана в дополнительных материалах и методах. Хотя в сыворотке плода обычно отсутствует C3-комплемент (32), мы подтвердили, что тепловая инактивация не была необходимой для нашей конкретной партии FBS в анализах совместного культивирования MSC: PBMC. Чтобы подтвердить использование FBS для совместного культивирования MSC-PBMC, PBMC, стимулированные Dynabeads, культивировали с 60000 прикрепленных или сфероидных MSC или без них. Этот эксперимент проводился в RPMI, содержащем 10% нормального или инактивированного нагреванием FBS из одной партии (дополнительный рисунок 2).При тепловой инактивации разницы не наблюдалось, поэтому все другие эксперименты проводили без тепловой инактивации. Описание термоинактивации FBS приведено в дополнительных материалах и методах.

Совместное культивирование МСК в транс-лунках

Прилипшие и сфероидные МСК помещали на дно 24-луночных планшетов в 700 мкл полной RPMI (составленной, как описано выше). PBMC окрашивали CSFE и объединяли с CD3 / CD28 Dynabeads с получением конечной концентрации 1 миллион PBMC / мл.Вставки для транс-лунок с порами 3 мкм (Corning, Cat # 07-200-148) добавляли в лунки, нагруженные MSC, и 250 мкл раствора Dynabead-PBMC помещали во вставки. Затем клетки культивировали в течение 6 дней перед анализом методом проточной цитометрии, как описано выше.

Пролиферация PBMC с ингибиторами BUD, PGE2, EP2 / 4

PBMC, выделенных от трех независимых неидентифицированных доноров крови, размораживали из криоконсервации. После восстановления клетки окрашивали CFSE, как описано выше, и активировали CD3 / CD28 Dynabeads.240 000 активированных PBMC с Dynabeads помещали в каждую экспериментальную лунку. Каждого донора РВМС высевали в двух экземплярах с необработанными активированными контролями на каждый планшет (один планшет для определения синергетического эффекта будесонида и PGE2 на предотвращение активации РВМС; один планшет использовали для определения способности ингибиторов рецептора EP предотвращать синергетический эффект). Конечные рабочие концентрации всех тестируемых соединений были следующими: будесонид (10 мкМ), PGE2 (1 мкМ, Tocris, № по каталогу 2296), TG4-155 (10 мкМ, Tocris, № по каталогу 5052) и L-161,982 (10 мкМ). мкМ, VWR, № по каталогу 75844-788).Те же концентрации использовали для экспериментов с МСК и без них.

Статистика

Все статистические данные и графики были подготовлены в GraphPad Prism 8. Перед статистическим анализом все данные были проанализированы на соответствие нормам с использованием теста Шапиро-Уилка. Каждая группа в каждом наборе данных прошла тест на нормальность ( p — пороговое значение 0,05). Планки погрешностей на графиках представлены как среднее ± SEM (стандартная ошибка среднего), если иное не указано в подписях к рисункам. Конкретные статистические тесты и поправки для множественных сравнений описаны в подписях к рисункам, а p <0.05 считался значимым для всех экспериментов.

Результаты

Сфероиды не могут подавить пролиферацию активированных PBMC

Чтобы проверить иммуномодулирующие свойства агрегированных МСК, мы использовали ранее разработанный протокол (14) для агрегирования МСК в сфероиды в течение 3 дней in vitro перед совместным культивированием с иммунными клетками человека (рисунки 1А, В). Затем мы проверили жизнеспособность МСК и обнаружили, в соответствии с предыдущими отчетами (18, 33, 34), увеличение МСК аннексина V + / PI + в группе сфероидов по сравнению с группой прикрепленных МСК (рисунок 1С, дополнительный рисунок 4).Чтобы определить, приводит ли увеличение гибели клеток к снижению количества сфероидных клеток с течением времени, мы использовали анализ, оптимизированный для сфероидов (CellTiter-Glo 3D, Promega), для количественной оценки количества жизнеспособных МСК в каждом сфероиде по сравнению со стандартной кривой жизнеспособных клеток. МСК. После 4 дней культивирования было обнаружено, что сфероиды содержат такое же количество жизнеспособных МСК, что и первоначально посеянные (20, 120 ± 860 МСК / сфероид). Таким образом, сфероиды МСК не атрофировались из-за гибели клеток и не росли в результате пролиферации, но оставались при стабильном количестве клеток.Затем мы попытались понять, влияет ли агрегация МСК на их взаимодействие с активированными Т-клетками. Хорошо известно, что адгезивные МСК подавляют пролиферацию PBMC, активированных с помощью CD3 / CD28 Dynabeads или с помощью MLR. Из-за известной вариабельности между донорами МСК мы использовали разных доноров МСК, полученных из коммерческих источников костного мозга и пуповины, выделенных и охарактеризованных в лаборатории (дополнительный рисунок 1). Как и ожидалось, прикрепленные МСК показали надежную способность подавлять пролиферацию PBMC (Рисунки 1D, E).Удивительно, но агрегация в сфероиды полностью устранила их иммуносупрессивную активность, несмотря на то, что было одинаковое начальное количество МСК, используемых как в прикрепленных, так и в сфероидных условиях (рисунки 1D, E).

Рисунок 1 . Сфероиды МСК не подавляют активированные РВМС. (A) Схема образования сфероида. 20000 МСК в свисающих каплях образуют сфероидные структуры в течение 3 дней культивирования. (B) Схема МСК в анализах иммуномодулирующей активности. (C) Типичные диаграммы потока адгезивных (Adh) и сфероидных (Sph) МСК, окрашенных FITC-аннексином V и пропидиум йодидом (PI) через 3 дня. (D) Типичные графики проточной цитометрии окрашенных CSFE PBMC с прилипшими (Adh) или сфероидными (Sph) МСК. (E) Количественная оценка% пролиферированных PBMC для N = 4 независимых донора MSC. Группы в D были проанализированы с помощью t -теста с поправкой Велча на неравные стандартные отклонения. Все данные представлены как среднее ± SEM.* p <0,05.

Доза сфероидов и контактные факторы не несут ответственности за потерю подавления распространения PBMC

Резкая потеря активности, которую мы наблюдали всего через 3 дня после образования сфероида, была неожиданной, поэтому мы стремились понять, почему сфероидные МСК теряют иммуносупрессивную активность, и было ли это специфичным для подавления PBMC. Предыдущие исследования показали, что сфероидные МСК проявляют противовоспалительное действие в отношении иммортализованных или мышиных макрофагов, несмотря на снижение жизнеспособности клеток (18, 34–36).В соответствии с этим мы обнаружили, что в совместных культурах с первичными макрофагами человека сфероиды МСК увеличивали продукцию противовоспалительных маркеров в M2c-M-CSF / BUD-поляризованных макрофагах (дополнительные рисунки 3B, D), в то время как сфероиды МСК в прямом контакте с M1 LPS / IFN-γ-поляризованные первичные макрофаги человека подавляли маркеры макрофагов M1 (дополнительные рисунки 3A, C). Таким образом, сфероидные МСК сохраняют иммуносупрессивную активность в отношении субпопуляций моноцитов. Затем мы проверили гипотезу о том, что потеря активности в отношении подавления PBMC была просто артефактом из-за уменьшения количества MSC в сфероидах либо из-за увеличения скорости гибели клеток, либо из-за снижения скорости пролиферации.Чтобы проверить эту гипотезу, мы культивировали PBMC с возрастающими дозами сфероидных MSC от нашей исходной дозы 1: 4 (60 000 MSC: 240 000 PBMC) до дозы, в 8 раз превышающей 2: 1 (480 000 MSC: 240 000 PBMC). Независимо от начальной дозы, сфероидные МСК полностью не подавляли пролиферацию PBMC (рис. 2A).

Рисунок 2 . Доза сфероида и контактные факторы не объясняют отсутствие подавления PBMC. (A) Процент пролиферации активированных PBMC с возрастающими дозами 20 000 клеточных сфероидов MSC.Односторонний дисперсионный анализ с тестом множественных сравнений Даннета. (B) пролиферация PBMC в ответ на совместное культивирование с прилипшими или сфероидными MSC при соотношении MSC к PBMC 1: 4 с MSC и PBMC, находящимися в прямом контакте или разделенными транс-лункой. Двусторонний дисперсионный анализ с поправкой Тьюки для множественных сравнений. Все данные представлены как среднее значение ± SEM с * p <0,05.

Альтернативное объяснение заключалось в том, что сфероидные МСК удалялись при контакте с цитотоксическими Т-клетками.Поскольку уничтожение цитотоксических Т-клеток зависит от контакта с клетками, мы стремились определить, были ли контактные факторы ответственны за потерю сфероидных МСК супрессии PBMC. Мы использовали транс-луночный анализ для предотвращения прямого контакта, в то же время позволяя обмен секретируемыми факторами между PBMC и сфероидными MSC. Несмотря на разделение клеток, сфероидные МСК по-прежнему не смогли подавить пролиферацию PBMC, в то время как прикрепленные МСК оставались супрессивными (Рисунок 2B).

Сфероидные МСК продуцируют иммуномодулирующие факторы

Обнаружив, что потеря активности не может быть связана с уменьшением количества клеток или факторов, опосредованных клеточным контактом, мы затем хотели определить, действительно ли сфероидные МСК способствуют, а не ингибируют пролиферацию PBMC.Чтобы проверить это, мы культивировали CD3 / CD28 Dynabead-активированные PBMC либо с прикрепленными МСК, либо с комбинацией прикрепленных и сфероидных МСК (соотношение Adh и Sph MSC 1: 5). Как и ожидалось, только прикрепленные МСК были подавляющими, но когда сфероиды были добавлены к прилипшим совместным культурам, пролиферация PBMC значительно увеличилась (Фигуры 3A, B). Таким образом, сфероидные МСК, по-видимому, либо активно поддерживают пролиферацию PBMC, либо потенциально ингибируют подавление с помощью прикрепленных МСК.

Рисунок 3 .МСК Spheroid демонстрируют измененный иммуномодулирующий профиль. Репрезентативные графики проточной цитометрии совместных культур активированных РВМС с прилипшими МСК или прикрепленных МСК с добавленными сфероидами в соотношении прикрепленных к сфероидам 1: 5 (A) с количественной оценкой% пролиферации в (B) . Данные анализировали с использованием одностороннего дисперсионного анализа с поправкой Тьюки для множественных сравнений. (C) Данные экспрессии гена RT-PCR для TGFB1, PTGS2 и IDO1 только в адгезивных и сфероидных МСК.МСК, используемые для IDO1 РНК , стимулировали 100 нг / мл IFN-γ в течение 3 дней перед анализом. Данные РНК для TGFB1 и PTGS2 анализировали с помощью теста t с поправкой Велча на неравные стандартные отклонения. (D) Количественная оценка белка вестерн-блоттингом COX-2 и IDO для адгезивных и сфероидных МСК с обработкой IFN-γ и без нее. Зарегистрированные соотношения белков были усреднены по N = 3 независимым экспериментам. (E) Анализ проточной цитометрии экспрессии CD73 на прикрепленных и сфероидных МСК.Статистические данные были выполнены с использованием теста t с поправкой Велча на неравные стандартные отклонения. ПГЕ-синтаза, IDO и продукты фермента CD73 PGE2 (F) , кинуренин (G) и свободный фосфат (H) , соответственно, измеренные для сфероидных и прикрепленных МСК после 3 дней культивирования (60000 клеток на состояние ). Статистический анализ в (F – H) был выполнен с использованием теста t с поправкой Велча на неравные стандартные отклонения.Все данные представлены как среднее значение ± SEM с * p <0,05 (DL, ниже предела обнаружения анализа).

Далее мы хотели определить, продуцируют ли сфероидные МСК иммуносупрессивные факторы, обычно связанные с МСК. Прилипшие и сфероидные МСК были проанализированы на экспрессию генов и продукцию известных иммуномодулирующих медиаторов (рис. 3С). Мы измерили уровни мРНК TGFB1, , кодирующего TGF-β, IDO1, , кодирующего индоламин-2,3-дезоксгеназу, и PTGS2, , кодирующего COX-2, который является критическим ферментом в пути синтеза простагландина (рис. 3C). .Поскольку IDO является индуцибельным белком, мы обрабатывали МСК с rhIFN-γ или без него, чтобы включить транскрипцию IDO. Мы обнаружили, что транскрипты TGFB1 и PTGS2 были увеличены в 2 и 500 раз, соответственно, в сфероидах по сравнению с их прикрепленными аналогами. При стимуляции rhIFN-γ IDO1 экспрессировалось на аналогичном уровне как в прикрепленных, так и в сфероидных МСК. Однако, в то время как IDO1 не обнаруживался в прикрепленных МСК без стимуляции rhIFN-γ, сфероидные МСК демонстрировали небольшую, но обнаруживаемую экспрессию IDO1 даже без стимуляции rhIFN-γ.

Для PTGS2 и IDO1 , показывающих различия на уровне РНК, мы затем измерили количество ферментов, которые они кодируют, COX-2 и IDO, соответственно (рис. 3D). Белок COX-2 был намного выше в сфероиде по сравнению с прикрепленными МСК, в то время как экспрессия IDO для обоих условий, стимулированных rhIFN-γ, была на аналогичных уровнях, что согласуется с измерениями мРНК. Однако в обеих группах без rhIFN-γ белок IDO обнаружен не был. Кроме того, мы исследовали CD73 (экто-5′-нуклеотидазу), поверхностный маркер hMSC, который также выполняет иммуномодулирующую функцию за счет превращения AMP в аденозин и свободный фосфат.Поскольку CD73 экспрессируется всеми МСК (дополнительный рисунок 1), мы изучили изменения уровней поверхностного белка фермента с помощью проточной цитометрии. В отличие от IDO, который не изменился, и COX-2, который был повышен, поверхностная экспрессия CD73 была значительно ниже в сфероиде по сравнению с прикрепленными МСК (рис. 3E).

Затем мы измерили активность трех иммуномодулирующих ферментов — ЦОГ-2, IDO и CD73 — в сфероидных МСК. В то время как PGE2, продукт COX-2 и простагландин E-синтазы, продуцировался прикрепленными МСК, он был примерно в 100 раз выше в сфероиде по сравнению с прикрепленными МСК (рис. 3F).Напротив, уровни ферментативных продуктов IDO и CD73, кинуренина и свободного фосфата были в 10 и 3 раза ниже, соответственно, в культурах сфероидных МСК (Фигуры 3G, H). Хотя это ожидалось для CD73, поскольку поверхностная экспрессия была снижена в сфероидах, эти результаты показали неожиданное несоответствие между уровнями белка IDO и активностью фермента. Таким образом, потеря MSC сфероидом подавляющей способности PBMC связана с резким увеличением продукции PGE2 и значительным снижением активности как IDO, так и CD73, что указывает на отчетливый иммуномодулирующий фенотип сфероидных MSC.

Подавление пролиферации PBMC с помощью сфероидных МСК может быть частично восстановлено в присутствии будесонида

В то время как потеря подавления PBMC вызывает беспокойство, в условиях клинической трансляции МСК часто вводят не сами по себе, а в сочетании со стандартной терапией. При воспалительных состояниях, таких как GvHD, болезнь Крона и язвенный колит, для лечения поражений может быть предпочтительным местное введение глюкокортикоидных стероидов (37). Будесонид — это широко используемый глюкокортикоидный стероид для местного применения из-за его плохой системной абсорбции и высокого метаболизма при первом прохождении (37).Таким образом, мы хотели определить, будет ли на взаимодействие сфероидных МСК с PBMC влиять присутствие будесонида (рис. 4A). Мы обнаружили, что сфероиды или будесонид (10 мкМ) сами по себе не способны подавлять CD3 / CD28-стимулированную пролиферацию PBMC, но комбинация сфероидов с будесонидом работает синергетически, значительно подавляя пролиферацию PBMC (рисунки 4B, C). Когда мы тестировали действие растворимого будесонида на прилипшие МСК, мы обнаружили, что пользы нет; скорее, мы наблюдали небольшое снижение способности MSC подавлять пролиферацию PBMC (Фигуры 4B, C).

Рисунок 4 . Будесонид действует синергетически со сфероидами, подавляя пролиферацию PBMC. (A) Схема графика совместного культивирования сфероидов с введением будесонида. Типичные графики проточной цитометрии (B) для совместных культур PBMC с обработкой 10 мкМ будесонидом и без нее, с количественной оценкой% пролиферации PBMC (C). (D) Анализ поколений PBMC с использованием программного обеспечения для пролиферации FlowJo v10 на основе данных проточной цитометрии, собранных в (B, C) .Процент общего количества PBMC отображается для каждого поколения (модель с 8 пиками). (E) Среднее образование PBMC рассчитывали из D, как описано в дополнительных материалах и методах. Двусторонний дисперсионный анализ с поправкой Сидака для множественных сравнений между контрольной группой и группами будесонида. Все данные представлены как среднее значение ± SEM с * p <0,05.

Помимо пролиферации, мы исследовали, влияет ли этот синергетический эффект на секрецию эффекторных цитокинов, продуцируемых PBMC при совместном культивировании с сфероидными МСК, в частности IFN-γ, IL-10 и гранзимом B.Одни только сфероидные МСК не влияли на уровни IFN-γ или гранзима B в совместной культуре, но наблюдалось значительное снижение уровня IL-10 (дополнительная фигура 5). Один будесонид оказывал значительное подавляющее действие на продукцию РВМС как IFN-γ, так и гранзима B (дополнительные фигуры 5A, C), но не оказывал значительного влияния на секрецию IL-10 (дополнительная фигура 5B). Вместе, будесонид и сфероидные МСК привели к еще большему снижению уровней IFN-γ, IL-10 и гранзима B (дополнительные рисунки 5A – C).Таким образом, синергизм будесонида со сфероидами МСК влияет как на пролиферацию РВМС, так и на результирующую цитокиновую среду.

Хотя подавление было усилено комбинацией будесонида с сфероидными МСК, профиль подавления сфероидных МСК с будесонидом качественно отличался от профиля прикрепленных МСК. Анализируя пики генерации CFSE, мы обнаружили, что доля пролиферирующих клеток в каждом поколении была сходной для совместных культур сфероидных MSC: PBMC с будесонидом и без него (рис. 4D).Однако соотношение непролиферативных к пролиферативным клеткам, независимо от поколения, было смещено в сторону непролиферативных ворот, когда будесонид был добавлен с сфероидными МСК, давая в целом более низкое среднее образование (рисунки 4D, E). Этот профиль подавления был неожиданным, так как прикрепленные МСК обычно останавливают пролиферацию после 0–2 событий удвоения (Figure 1C). Таким образом, в отличие от прикрепленных МСК, сфероидные МСК в комбинации с будесонидом демонстрируют отчетливую картину подавления. Поскольку этот профиль подавления отличался от прикрепленных МСК, мы предположили, что он не был вызван кинуренином.Чтобы проверить эту гипотезу, мы обрабатывали сфероидные МСК с будесонидом и без него в присутствии воспалительного цитокина IFN-γ, чтобы определить, увеличивает ли будесонид продукцию кинуренина сфероидными МСК. Мы обнаружили, что будесонид не влиял на продукцию кинуренина сфероидными МСК, предполагая, что существует, вероятно, другой подавляющий фактор, доминирующий над синергическим эффектом, наблюдаемым с сфероидными МСК и будесонидом в совместном культивировании (дополнительный рисунок 6).

Произведенный сфероидом PGE2 недостаточно для подавления пролиферации PBMC

Поскольку PGE2 был наиболее активным из наблюдаемых нами факторов (рис. 3), мы хотели определить, может ли только PGE2 вызывать подавление пролиферации PBMC.Таким образом, мы измерили PGE2 в совместных культурах MSC-PBMC и обнаружили, что PGE2 был повышен в совместных культурах, содержащих сфероиды, достигая пика 85 нМ (рис. 5A). Как и ожидалось (38), уровни PGE2 были выше без будесонида, но PGE2 из обеих групп сфероидных МСК были намного выше, чем уровни, измеренные в контроле со стимулированными РВМС (рис. 5А). Для определения IC50 PGE2, необходимого для подавления самих PBMC, мы обрабатывали активированные PBMC возрастающими дозами синтетического PGE2 и измеряли пролиферацию клеток.Значения IC50, рассчитанные для трех разных доноров PBMC, находились в диапазоне 10-25 мкМ, что более чем в 100 раз выше, чем пиковая концентрация PGE2, измеренная в совместных культурах со сфероидными МСК (рис. 5B). Поскольку уровни PGE2, продуцируемого сфероидами MSC, были слишком низкими, чтобы учесть подавление PBMC как таковое, мы предположили, что продуцируемый сфероидом PGE2 может синергетически взаимодействовать с будесонидом, давая подавляющий эффект.

Рисунок 5 . Уровни PGE2, продуцируемые сфероидом, сами по себе недостаточны для подавления PBMC. (A) PGE2, измеренный с помощью конкурентного ELISA в культурах PBMC без МСК или совместных культур со сфероидными МСК с 10 мкМ будесонидом и без него ( t -тест с поправкой Велча на неравные стандартные отклонения. Все данные представлены как среднее ± SEM с * p <0,05). Пунктирная линия представляет предел обнаружения анализа. (B) Возрастающие дозы синтетического PGE2 добавляли к активированным PBMC и измеряли пролиферацию для определения значений IC50 трех независимых доноров PBMC.Реплики для каждого донора PBMC были усреднены, и среднее значение отображается. Каждая кривая представляет один из трех различных доноров PBMC, используемых в этом эксперименте ( N, = 3 донора PBMC). Значения IC50 рассчитывали из четырехпараметрического логарифма (ингибитор) в сравнении с моделью ответа в GraphPad Prism 8 для каждого донора РВМС независимо. Пунктирная линия представляет среднюю концентрацию PGE2 из сфероида с группой будесонида в (A) .

Сфероидные МСК секретируют PGE2, который взаимодействует с будесонидом для подавления пролиферации активированных Т-клеток

Мы хотели определить, может ли синергизм между PGE2 из сфероидных МСК и будесонидом в нашем анализе активности PBMC быть нарушен путем блокирования передачи сигналов PGE2.Чтобы проверить это, мы обработали PBMC сфероидами MSC и будесонидом и добавили селективные антагонисты рецепторов PGE2 EP2 и EP4 (TG4-155 и L-161 432), которые считаются критическими для PGE2-опосредованного подавления PBMC (39). Как и прежде, сфероиды и будесонид взаимодействовали друг с другом, подавляя пролиферацию PBMC (рис. 6A). Однако при добавлении ингибиторов EP2 / 4 этот подавляющий эффект был утрачен. Поскольку ни один из ингибиторов или комбинаций будесонида не влиял только на пролиферацию PBMC (дополнительная фигура 7A), эти результаты предполагают, что синергизм между сфероидными МСК и будесонидом обусловлен, по крайней мере, частично передачей сигналов PGE2, опосредованной рецепторами EP2 / EP4.

Рисунок 6 . Сфероид PGE2 взаимодействует с будесонидом через рецепторы EP2 / 4 на Т-клетках. (A) PBMC или (B) Ответ пролиферации Т-клеток на сфероиды с или без 10 мкМ будесонида или ингибиторов EP2 / 4 TG4-155 / L161, 982 (10 мкМ). Статистический анализ проводился с использованием однофакторного дисперсионного анализа с поправкой Сидака для множественных сравнений с группой, не получавшей лечения, без лекарственного средства. (C) пролиферация PBMC отдельно или после воздействия 1 мкМ синтетического PGE2 и 10 мкМ будесонида.Статистический анализ проводили с использованием однофакторного дисперсионного анализа с поправкой Сидака для множественных сравнений с группой, не получавшей лечения только РВМС. (D) PBMC, обработанные будесонидом и синтетическим PGE2, как в (C) , с или без ингибиторов EP2 и EP4 TG4-155 и L-161, 982 в концентрации 10 мкМ. Статистический анализ проводился с использованием однофакторного дисперсионного анализа с поправкой Сидака для множественных сравнений с контрольной группой. Все данные представлены как среднее значение ± SEM с * p <0,05.

Затем мы хотели определить, может ли синергизм, наблюдаемый между сфероидными МСК и будесонидом, действовать непосредственно на Т-клетки, или же подавляющий эффект зависел от не-Т-клеточных сторонних наблюдателей в популяции PBMC.Мы использовали набор для отрицательной селекции для удаления популяций не Т-клеток из PBMC и совместно культивированных сфероидных МСК с оставшимися Т-клетками. Добавление сфероидов и будесонида к активированным CD3 / CD28 Dynabead Т-клеткам снова привело к подавляющему эффекту на пролиферацию, который блокировался добавлением ингибиторов EP2 / 4 (фиг. 6B). Как и в случае с PBMC, комбинации лекарственных средств сами по себе не оказали существенного влияния на пролиферацию Т-клеток (дополнительная фигура 7B). Эти данные предполагают, что продуцируемый MSC будесонидом и сфероидом PGE2 может действовать на Т-клетки, не требуя, чтобы сторонний наблюдатель, не являющийся Т-клеткой, опосредовал подавляющий эффект.

Будесонид работает синергетически с PGE2 для подавления пролиферации PBMC

Поскольку будесонид может действовать как на МСК, так и на PBMC, мы затем хотели определить, могут ли синтетический PGE2 и будесонид работать синергетически на PBMC, реплицируя подавление, наблюдаемое с сфероидными МСК, чтобы поддержать гипотезу о том, что PGE2 из сфероидных МСК и будесонид работают синергетически. для подавления пролиферации PBMC. Мы лечили PBMC низкой дозой PGE2 с будесонидом или без него.Как предполагалось, ни PGE2, ни будесонид по отдельности не подавляли пролиферацию PBMC, в то время как комбинация приводила к значительному и значительному снижению пролиферации (рис. 6C). Как и в случае совместных культур со сфероидами МСК, добавление ингибиторов EP2 / EP4 к PBMC, обработанным синтетическим PGE2 и будесонидом, привело к потере супрессии и увеличению пролиферации PBMC (фигура 6D). Блокада только EP2 только частично блокировала супрессивный эффект, в то время как включение обоих ингибиторов вместе приводило к более существенному снижению подавления пролиферации PBMC.

Сфероиды МСК, полученные из костного мозга и пуповины, теряют подавление, но восстанавливают некоторое подавление с лечением будесонидом для множественных пар доноров PBMC

В этой работе мы сделали два основных вывода относительно сфероидных МСК: они теряют подавление пролиферации PBMC и что лечение будесонидом может частично восстанавливать активность сфероидных МСК. Поскольку источники MSC часто отличаются высокой вариабельностью, мы хотели определить, можно ли обобщить эти результаты для ряда доноров MSC и нескольких доноров PBMC.Чтобы проверить возможность обобщения наших результатов, мы сгенерировали 18 уникальных пар МСК: МПК с использованием МСК костного мозга от трех доноров и МСК пуповины от трех доноров в паре с тремя разными донорами МПК, а затем исследовали подавление МПК прикрепленных МСК, сфероидных МСК или сфероидов. МСК с будесонидом для каждой пары. Разбивка данных по донорам MSC (фигура 7A) и донорам PBMC (фигура 7B) показала, что прикрепленные MSC во всех 18 парах подавляли пролиферацию PBMC, в то время как ни один из сфероидных MSC, содержащих условия, не демонстрировал какого-либо подавления пролиферации (фигура 7A).Таким образом, наблюдаемая потеря подавления PBMC сфероидными МСК была обобщена для всех 18 пар доноров. Добавление будесонида к совместным культурам сфероидных МСК снизило пролиферацию МПК во всех 18 парах доноров по сравнению с группами сфероидных МСК и привело к супрессивному фенотипу в 14 из 18 пар (рис. 7A), что позволяет предположить, что спасение сфероидного MSC-супрессивного фенотипа возможно. широко обобщаемый.

Рисунок 7 . Потеря подавления и синергизма сфероидных МСК с будесонидом распространена на множественные пары МСК-МПК, полученные из костного мозга и пуповины.Шесть доноров MSC (MSC00082, MSC00055, MSC7083, UC4078, UC4373 и UC4477) были совместно культивированы с тремя независимыми донорами PBMC (18,1, 19,1, 19,3) для создания 18 уникальных пар MSC-PBMC ( N = 6 доноров MSC, N = 3 донора PBMC). (A) Анализировали пролиферацию PBMC на адгезивные, сфероидные или сфероидные с 10 мкМ будесонидом, нормализованные к стимулированным контрольным PBMC, через 6 дней. (B) Данные, собранные в A, сгруппированы по донору PBMC. (C) 240 000 МСК в 20 000 клеточных сфероидов, в 4 раза больше клеток в группе сфероидов культивировали с PBMC и измеряли пролиферацию PBMC.

Наконец, мы проверили, приведет ли увеличение дозы MSC в 4 раза для учета различий в количестве MSC из-за различий в жизнеспособности или пролиферации к подавлению пролиферации PBMC. В соответствии с нашим первоначальным наблюдением на рисунке 2A, двухфакторный дисперсионный анализ показал, что увеличение дозы сфероидных МСК (с 3 сфероидов до 12 сфероидов) существенно не изменило уровень подавления PBMC (рисунок 7C). Таким образом, увеличение дозы сфероидных MSC не является надежной стратегией для улучшения подавления пролиферации PBMC сфероидными MSC.

Обсуждение

Иммуномодулирующий фенотип

MSC изучается в течение многих лет с использованием 2D-адгезивных культур на пластике для тканевых культур; однако МСК, которым вводили in vivo, находились в совершенно ином окружении. В частности, есть доказательства того, что в определенных контекстах локальной доставки МСК агрегируют in vivo и (14, 17), что изменяет репертуар трофических факторов, продуцируемых клетками (18, 19, 40). Возникает вопрос: являются ли сфероидные МСК более иммуномодулирующими, чем их прикрепленные аналоги, или у них другой иммуномодулирующий профиль?

Подавление PBMC, Т-клеток или MLR уже давно используется в качестве анализов in vitro для оценки эффективности человеческих МСК перед использованием in vivo (3, 27, 28, 41).В этом исследовании мы исследовали активность адгезивных и сфероидных МСК в серии анализов in vitro с использованием исключительно первичных клеток человека. Мы ожидали, что сфероидные МСК будут подавлять активированную пролиферацию РВМС дозозависимым образом, но были удивлены, обнаружив, что сфероидные МСК вообще не проявляли супрессивной активности, как было измерено с помощью анализов пролиферации РВМС, IFN-γ и гранзима B.

Эта полная и быстрая потеря потенции была неожиданной и первоначально считалась артефактом наших анализов потенции или выбора доноров.Однако такая же потеря активности при формировании сфероида наблюдалась у шести независимых доноров человеческих МСК, полученных как из пуповины, так и из костного мозга, в паре с тремя отдельными донорами РВМС. Когда данные с несколькими донорами были проанализированы с помощью двухфакторного дисперсионного анализа с помощью теста множественных сравнений Тьюки, он показал, что сфероидные МСК были значительно хуже, чем прикрепленные МСК (95% ДИ разницы: от -92 до -85) в подавлении пролиферации PBMC и добавлении будесонид привел к значительному улучшению подавления сфероидных МСК (95% ДИ разницы: от 12 до 31).В целом, 95% наблюдаемой вариации было отнесено к условиям совместного культивирования, в то время как взаимодействие донора РВМС, донора МСК и донора МСК: донора РВМС объяснялось <1% наблюдаемой вариации. Это продемонстрировало, что потеря активности не зависела от используемой пары доноров.

Эти находки могут противоречить работе, выполненной Zimmermann et al., Которые показали, что необработанные сфероидные МСК подавляли активированные РВМС при соотношении МСК: РВМС 3: 1 (42). Однако размеры исследуемых сфероидов существенно различаются.Хотя мы использовали 20 000 МСК во всех сфероидах, Zimmermann et al. использовали сфероиды, содержащие всего 500 клеток, и было показано, что размер агрегатов существенно влияет на секретом сфероидов (19, 42). Хотя такие небольшие размеры можно контролировать в лаборатории, мы выбрали более крупные агрегаты, чтобы более точно описать спонтанную агрегацию, которая могла бы происходить при локальной инъекции концентрированной клеточной суспензии in vivo (14).

Последующий анализ экспрессии и продукции иммуномодулирующих факторов показал общий сдвиг в иммуномодулирующем фенотипе между адгезивными и сфероидными МСК.Хотя МСК известны своими противовоспалительными свойствами, некоторые из этих иммуномодулирующих факторов не активируются до тех пор, пока МСК не подвергаются воздействию воспалительных факторов, включая IFN-γ, который, как было показано, усиливает экспрессию белков IDO и COX-2. Мы использовали IFN-γ для индукции экспрессии как IDO, так и COX-2, чтобы охарактеризовать различия между ответами адгезивных и сфероидных МСК на контролируемый воспалительный стимул. Экспрессия TGFB1 , уровни белка CD73 и активность как IDO, так и CD73 различались между адгезивными и сфероидными МСК.Однако наиболее поразительным наблюдаемым изменением сфероидов было увеличение экспрессии PTGS2 , белка COX-2 и секреции PGE2 в сфероидных МСК по сравнению с их прикрепленными аналогами.

Сфероиды не только не были способны подавлять пролиферацию Т-клеток, но они фактически поддерживали пролиферацию, вероятно, из-за сдвига в балансе между производством противовоспалительных и противовоспалительных факторов. Хотя МСК наиболее известны своими противовоспалительными свойствами, они конститутивно экспрессируют ряд классических провоспалительных цитокинов и хемокинов (43).Кроме того, было показано, что специфические факторы окружающей среды, такие как ЛПС (44), TNF-α (43, 45) и пальмитат (27, 44), поляризуют МСК в сторону провоспалительного состояния. В сфероидах Bartosh et al. показали, что МСК также продуцируют провоспалительные цитокины, такие как IL-1α / β (14), которые могут способствовать размножению Т-клеток (46). Хотя это и не рассматривается в этом исследовании, необходимы дополнительные исследования, чтобы понять механизм, заставляющий сфероидные МСК терять способность подавлять активированные МКПК, и то, как комбинации различных стимулов контролируют баланс противовоспалительных и провоспалительных продуктов, продуцируемых МСК.

Другими стимулами, влияющими на взаимодействие МСК с иммунными клетками, являются стандартные иммунодепрессанты, которые пациенты получают перед терапией МСК. Глюкокортикоидные стероиды обычно используются у пациентов с воспалительными заболеваниями и могут влиять как на иммунные клетки реципиента, так и на трансплантированные МСК. Исследования влияния стероидов на МСК были ограничены, но предполагают, что это взаимодействие требует более обширных исследований и понимания. Например, Chen et al. показали, что мышиные МСК, обработанные дексаметазоном, снижают подавление активированных анти-CD3 спленоцитов (47).Когда они исследовали человеческие МСК, они обнаружили, что дексаметазон снижает экспрессию МСК иммуномодулирующих белков, индуцируемых воспалением. Однако есть свидетельства того, что лечение стероидами может также положительно влиять на функцию МСК. Обработанные дексаметазоном МСК подавляют экспрессию IFN-γ, перфорина и CD69 в популяциях NK-клеток (48). Кроме того, ранее мы показали, что загрузка МСК внутриклеточными микрочастицами, содержащими будесонид, усиливает их подавление мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) (2).Однако в текущем исследовании прикрепленные МСК, обработанные солюбилизированным будесонидом в совместном культивировании с PBMC, не продемонстрировали улучшенной супрессорной способности. В этом исследовании мы использовали будесонид, обычно используемый стероид для местного применения, чтобы понять влияние глюкокортикоидов на взаимодействия сфероидных МСК: МКПК. К нашему удивлению, хотя ни сфероидные МСК, ни будесонид по отдельности не подавляли пролиферацию Т-клеток, вместе они значительно подавляли пролиферацию Т-клеток. Интересно, что 3 из 4 пар MSC-PBMC, которые не показали этого подавления между сфероидными MSCs и будесонидом, были с донором 18 PBMC.1, который мы ранее наблюдали, был менее чувствителен к PGE2, чем 2 других донора PBMC (рис. 5B). Это говорит о том, что различия в чувствительности PBMC к PGE2 могут влиять на способность будесонида взаимодействовать с сфероидным PGE2 для подавления пролиферации PBMC. Хотя многие факторы, основанные на сфероидных МСК, могут взаимодействовать со стероидами, мы сосредоточились на понимании роли сфероидного продуцирования PGE2, наиболее высоко регулируемого фактора в сфероидных МСК, и сыграли в наблюдаемом синергизме. PGE2, хотя и присутствовал в среде для совместного культивирования MSC spheroid: PBMC, имел концентрацию в 100 раз слишком низкую, чтобы сам по себе вызывать подавление.Мы обнаружили, что интактная передача сигналов PGE2 имеет решающее значение для синергизма с будесонидом, поскольку ингибирование рецепторов EP2 / 4 полностью устраняет синергию. Кроме того, синергизм между PGE2 и будесонидом, по-видимому, не зависит от популяций, не относящихся к Т-клеткам, поскольку их истощение не нарушает синергизм между сфероидным PGE2 и будесонидом. Таким образом, синергизм, по-видимому, действует непосредственно на Т-клетки и зависит от интактной передачи сигналов EP2 / 4. Мы подтвердили, что продукция кинуренина из сфероидных МСК не увеличивалась при лечении будесонидом, что дополнительно подтверждает наши данные, показывающие, что подавление пролиферации МКПК с помощью МСК перешло от механизма с доминированием кинуренина к механизму, опосредованному PGE2-будесонидом.

Интересно, что и PGE2, и глюкокортикоиды обладают известными эффектами на передачу сигналов TCR. Передача сигналов PGE2 через EP2 / 4 увеличивает уровни цАМФ, которые активируют PKA, которая, в свою очередь, может фосфорилировать LCK ⁵⁰⁵ , что имеет решающее значение для начального образования комплекса передачи сигналов TCR / CD3 (49). Таким образом, передача сигналов PGE2 может быть усилена глюкокортикоидами, поскольку они могут связываться с цитоплазматическим глюкокортикоидным рецептором (GR), а также активировать PKA, что приводит к ингибированию LCK (50). Эта передача сигналов затем ускоряет диссоциацию комплекса LCK / FYN, снижая передачу сигналов TCR (50).Кроме того, было показано, что PGE2 ингибирует экспрессию медиаторов воспаления, таких как IFN-γ и IL-17, посредством регуляции транскрипции (3). Комплекс глюкокортикоид-GR действует как фактор транскрипции, чтобы модулировать активацию воспалительных генов, часто подавляя передачу сигналов NFκB, что имеет решающее значение для экспрессии цитокинов при активации Т-клеток (51).

В нашей системе мы показали, что передача сигналов PGE2 через рецепторы EP2 / 4 имеет решающее значение для синергии сфероидных МСК-будесонид в подавлении человеческих Т-клеток.Поскольку передача сигналов ниже по течению как PGE2, так и будесонида затрагивает путь PKA / LCK / TCR, вместе они оказываются способными к подавляющему эффекту, которого ни один из них не может достичь в одиночку. Кроме того, заменив сфероиды МСК синтетическим PGE2, мы смогли воспроизвести этот синергетический эффект, предполагая, что PGE2 из сфероидов действительно является преобладающей сигнальной молекулой, продуцируемой МСК, которая работает синергетически с будесонидом для подавления пролиферации Т-клеток.

Хотя это исследование дает существенное представление о взаимодействии сфероидных МСК с Т-клетками, существуют ограничения, которые следует учитывать при интерпретации данных.Во-первых, вся работа по подавлению PBMC была проведена с использованием иммунных клеток, выделенных из периферической крови. Однако при местной инъекции МСК будут взаимодействовать как с резидентными тканями, так и с привлеченными Т-клетками с периферии. Резидентные в ткани Т-клетки могут иметь значительные различия в ответах, включая экспрессию, пролиферацию и подвижность генов (52). Кроме того, в нашем исследовании преимущественно использовался ответ пролиферации PBMC в качестве меры воспаления на основе PBMC. Хотя при определенных обстоятельствах пролиферация коррелирует с секрецией воспалительных цитокинов, пролиферация и эффекторные функции, включая секрецию цитокинов, цитотоксическое уничтожение и поляризацию Т-клеток, не всегда коррелируют (2, 53).Кроме того, в этом исследовании не рассматривались другие иммунные субпопуляции, которые могут составлять значительную часть медиаторов воспаления в тканях, таких как NK-клетки, которые обладают как цитолитической, так и воспалительной функцией. Дальнейшие исследования взаимодействий с другими иммунными клетками и сложных взаимодействий между множественными популяциями иммунных клеток необходимы для лучшего понимания функции агрегированных МСК после трансплантации in vivo .

В заключение, агрегированные МСК человека теряют способность подавлять пролиферацию активированных Т-клеток.Хотя сфероидные МСК сами по себе не подавляют пролиферацию Т-клеток, при помещении в среду с будесонидом, глюкокортикоидным стероидом, они восстанавливают подавляющую способность. Используя серию ингибиторов и дополнительных исследований, мы обнаружили, что продуцируемый сфероидными МСК PGE2 может действовать на рецепторы EP2 / EP4 на Т-клетках в синергии с будесонидом, подавляя пролиферацию Т-клеток. Мы обнаружили, что эти результаты можно обобщить для всех 18 пар доноров MSC: PBMC, которые мы тестировали. Хотя синтетического PGE2 достаточно для репликации подавления, опосредованного сфероид-будесонидом, это не означает, что сфероиды МСК являются терапевтически ненужными.Преимущество клеточной терапии перед синтетическими лекарствами всегда заключалось в их способности скоординированно продуцировать множество факторов для устранения воспаления и ускорения регенерации тканей. В этом исследовании мы сосредоточились на иммуномодулирующих свойствах сфероидных МСК, но не оценивали их продукцию антимикробных, ростовых, нейропротекторных или антиапоптотических факторов. В зависимости от потребностей конкретного показания к болезни, сфероидные МСК могут сохранять достаточный набор терапевтических медиаторов, чтобы оправдать их использование, и выбор терапии МСК всегда должен производиться в контексте процесса заболевания и требуемых механизмов действия (54). .Для воспалительных состояний подавление Т-лимфоцитов является важной частью разрешения воспаления, и это исследование подчеркивает важность понимания влияния агрегации клеток на иммуномодулирующий фенотип МСК и того, как эффективность этого фенотипа зависит от наличия других факторов окружающей среды.

Заявление о доступности данных

Наборы данных, созданные для этого исследования, доступны по запросу соответствующему автору.

Заявление об этике

Человеческие пуповины были взяты из банка материнских тканей плода Университета штата Айова с письменным информированным согласием матерей (IRB # 2004).

Авторские взносы

Концепция и дизайн экспериментов были выполнены AB, LD, LB и JA. Сбор и / или сборка данных и написание рукописи были выполнены AB, LD, LB, DB, MS и JA. Анализ и интерпретация данных выполнялись AB, LD, LB, MS и JA. Окончательное одобрение рукописи было дано AB, LD, LB, DB, MS, DS и JA. Предоставление материалов для исследования или пациентов было предоставлено DS и JA. Финансовую поддержку оказала JA.

Финансирование

AB поддерживался грантом на обучение NIH (№ 1T32NS045549), а LB частично поддерживался грантом NIH на обучение № 5T32GM007337.Для завершения проекта была использована поддержка Фонда Штрауба, Фонда исследований и образования в области диабета и Центра исследования диабета Братского ордена Орлов, присужденных JA. Некоторые химические реагенты / реагенты среды, использованные для этой работы, были предоставлены JA в рамках гранта BD Immunology Grant и премии Biological Industries USA Research Award. DS был поддержан Сетью стратегически ориентированных исследований Американской кардиологической ассоциации (номера грантов 15 SFRN 23730000, 18679000, 18679001, 18679002, 18679003).Репозиторий тканей женского здоровья был поддержан Медицинским колледжем Карвера, кафедрой акушерства и гинекологии и Национальным центром развития трансляционных наук Национальных институтов здравоохранения под номером награды UL1TR002537.

Конфликт интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https: // www.frontiersin.org/articles/10.3389/fimmu.2020.00143/full#supplementary-material

Список литературы

1. François M, Romieu-Mourez R, Li M, Galipeau J. Подавление МСК человека коррелирует с индукцией цитокинами индоламин-2,3-диоксигеназы и дифференцировкой макрофагов M2 сторонних наблюдателей. Мол тер . (2012) 20: 187–95. DOI: 10.1038 / mt.2011.189

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

2. Анкрум Дж., Дастидар Р.Г., Онг Дж. Ф., Леви О., Карп Дж. М..Мезенхимальные стволовые клетки с улучшенными характеристиками за счет внутриклеточной доставки стероидов. Научная репутация . (2014) 4: 4645. DOI: 10.1038 / srep04645

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

3. Розенберг А., Резк А., Бойвин М.Н., Дарлингтон П.Дж., Ньиренда М., Ли Р. и др. Мезенхимальные стволовые клетки человека влияют на ответы Th27 и Th2 через простагландин E2 и миелоид-зависимый механизм. Стволовые клетки, перевод, медицина, . (2016) 5: 1506–14. DOI: 10.5966 / sctm.2015-0243

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

5.Dominici M, Le Blanc K, Mueller I, Slaper-Cortenbach I, Marini F, Krause D и др. Минимальные критерии для определения мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток. Заявление о позиции Международного общества клеточной терапии. Цитотерапия . (2006) 8: 315–17. DOI: 10.1080 / 14653240600855905

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

6. Шин Е.Ю., Ван Л., Земскова М., Деппен Дж., Сюй К., Стробель Ф. и др. Продукция аденозина мезенхимальными стромальными клетками, поддерживаемыми биоматериалом, снижает врожденный воспалительный ответ при ишемии / реперфузии миокарда. Дж. Эм Харт Ассорс . (2018) 7: e006949. DOI: 10.1161 / JAHA.117.006949

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

7. Инглиш К., Райан Дж. М., Тобин Л., Мерфи М. Дж., Барри Ф. П., Махон Б. П.. Контакт с клетками, простагландин E (2) и трансформирующий фактор роста бета 1 играют неизбыточную роль в индукции мезенхимальными стволовыми клетками человека CD4 + CD25 (высокий) P3 + регуляторных Т-клеток вилочного блока. Клин Эксперимент Иммунол . (2009) 156: 149–60. DOI: 10.1111 / j.1365-2249.2009.03874.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

8. Шиванатан К.Н., Рохас-Каналес Д.М., Хоуп К.М., Кришнан Р., Кэрролл Р.П., Гронтос С. и др. Мезенхимальные стволовые клетки человека, индуцированные интерлейкином-17A, являются лучшими модуляторами иммунологической функции. Стволовая клетка . (2015) 33: 2850–63. DOI: 10.1002 / стержень.2075

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

9. Ли Р. Х., Ю. Дж. М., Фоскетт А. М., Пельтье Дж., Рено Дж. К., Бажанов Н. и др.TSG-6 в качестве биомаркера для прогнозирования эффективности человеческих мезенхимальных стволовых / предшественников (hMSC) в модуляции стерильного воспаления in vivo . Proc Natl Acad Sci USA . (2014) 111: 16766–71. DOI: 10.1073 / pnas.1416121111

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

11. Молл Дж., Анкрум Дж., Камхи-Милц Дж., Бибак К., Рингден О., Фольк Х-Д и др. Диверсификация препаратов для внутрисосудистой терапии мезенхимальными стромальными / стволовыми клетками: время для новых клинических руководств. Тенденции Мол Меди . (2019) 25: 149–63. DOI: 10.1016 / j.molmed.2018.12.006

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

12. Лю И-И, Чан Ч. С., Хунг С. С., Чиан Ц. Ф., Цай Ц. Л., Чен В. К. и др. Мезенхимальные стволовые клетки, обусловленные гипоксией, улучшают повреждение легких, вызванное ишемией / реперфузией. PLOS ONE . (2017) 12: e0187637. DOI: 10.1371 / journal.pone.0187637

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

13.Sugiyama Y, Sato Y, Kitase Y, Suzuki T, Kondo T, Mikrogeorgiou A и др. Внутривенное введение мезенхимальных стволовых клеток костного мозга, но не стволовых клеток жировой ткани, улучшило неонатальное гипоксически-ишемическое повреждение головного мозга за счет изменения воспалительного состояния мозга у крыс. Передний Neurol . (2018) 9: 757. DOI: 10.3389 / fneur.2018.00757

CrossRef Полный текст | Google Scholar

14. Бартош TJ, Ylostalo JH, Бажанов N, Kuhlman J, Prockop DJ. Динамическое уплотнение человеческих мезенхимальных стволовых клеток / клеток-предшественников в сферы самоактивирует каспазозависимую передачу сигналов IL1 для усиления секреции модуляторов воспаления и иммунитета (PGE2, TSG6 и STC1). Стволовая клетка . (2013) 31: 2443–56. DOI: 10.1002 / стержень.1499

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

15. Braid LR, Wood CA, Wiese DM, Ford BN. Внутримышечное введение увеличивает время пребывания мезенхимальных стромальных клеток по сравнению с другими путями. Цитотерапия . (2018) 20: 232–44. DOI: 10.1016 / j.jcyt.2017.09.013

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

16. Занотти Л., Сарухан А., Дандер Е., Кастор М., Сибелла Дж., Солдани С. и др.Инкапсулированные мезенхимальные стволовые клетки для иммуномодуляции in vivo . Лейкемия . (2013) 27: 500–3. DOI: 10.1038 / leu.2012.202

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

17. Юнгвирт Н., Салинас Техедор Л., Джин В., Гуди В., Скрипулец Т., Стейн В.М. и др. Мезенхимальные стволовые клетки образуют трехмерные кластеры после внутрижелудочковой трансплантации. Дж. Мол Neurosci . (2018) 65: 60–73. DOI: 10.1007 / s12031-018-1070-x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

18.Бартош Т.Дж., Илостало Дж. Х., Мохаммадипур А., Бажанов Н., Кобл К., Клейпул К. и др. Агрегация мезенхимальных стромальных клеток человека (МСК) в трехмерные сфероиды усиливает их противовоспалительные свойства. Proc Natl Acad Sci USA . (2010) 107: 13724–9. DOI: 10.1073 / pnas.1008117107

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

19. Се Л., Мао М., Чжоу Л., Чжан Л., Цзян Б. Сигнальные факторы, секретируемые двумерными и сфероидными мезенхимальными стволовыми клетками и сокультурами мезенхимальных стволовых клеток, происходящих из микровезикул и нейронов фоторецепторов сетчатки. Стволовые клетки Инт . (2017) 2017: 2730472–13. DOI: 10.1155 / 2017/2730472

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

20. Ylostalo JH, Bartosh TJ, Coble K, Prockop DJ. Человеческие мезенхимальные стволовые / стромальные клетки, культивируемые в виде сфероидов, самоактивируются с образованием простагландина E2, который направляет стимулированные макрофаги в противовоспалительный фенотип. Стволовая клетка . (2012) 30: 2283–96. DOI: 10.1002 / стержень.1191

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

21.Ли Й, Лю В., Лю Ф, Цзэн Й, Цзо С., Фэн С. и др. Приготовленные трехмерные инъекционные микроники для лечения критической ишемии конечностей с использованием низкодозированных клеток. Proc Natl Acad Sci USA . (2014) 111: 13511–16. DOI: 10.1073 / pnas.1411295111

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

22. Guo L, Ge J, Zhou Y, Wang S, Zhao RCH, Wu Y. Мезенхимальные стволовые клетки, культивируемые в трехмерных сфероидах, лишенные эмболии, уменьшают повреждение мозга после инсульта после внутриартериальной инъекции. Разработка стволовых клеток . (2014) 23: 978–89. DOI: 10.1089 / scd.2013.0338

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

23. Xu Y, Shi T, Xu A, Zhang L. 3D культура сфероидов увеличивает выживаемость и терапевтические возможности МСК, введенных в ишемическую почку. Дж. Ячейка Мол Меди . (2016) 20: 1203–13. DOI: 10.1111 / jcmm.12651

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

24. Ямагути Ю., Оно Дж., Сато А., Кидо Х., Фукусима Т.Сфероиды мезенхимальных стволовых клеток обладают повышенным остеорегенеративным потенциалом in vitro и in vivo. БМК Биотехнология . (2014) 14: 105. DOI: 10.1186 / s12896-014-0105-9

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

25. Rettinger CL, Fourcaudot AB, Hong SJ, Mustoe TA, Hale RG, Leung KP. In vitro характеризация трехмерных агрегатов мезенхимальных стволовых клеток без каркаса. Клеточная ткань Res . (2014) 358: 395–405. DOI: 10.1007 / s00441-014-1939-0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

26. Анкрум Дж., Онг Дж. Ф., Карп Дж. М.. Мезенхимальные стволовые клетки: невосприимчивые, не иммунные. Нат Биотехнология . (2014) 32: 252–60. DOI: 10.1038 / NBT.2816

CrossRef Полный текст | Google Scholar

27. Боланд Л., Буранд А.Дж., Браун А.Дж., Бойт Д., Лира В.А., Анкрум Дж. Предварительное лицензирование IFN-γ и TNF-α защищает мезенхимальные стромальные клетки от провоспалительных эффектов пальмитата. Мол тер . (2018) 26: 860–73. DOI: 10.1016 / j.ymthe.2017.12.013

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

28. Ким Д.С., Чан И.К., Ли М.В., Ко Ю.Дж., Ли Д.Х., Ли Дж.В. и др. Усиленные иммуносупрессивные свойства мезенхимальных стволовых клеток человека, примированных интерфероном-γ. EBioMedicine . (2018) 28: 261–73. DOI: 10.1016 / j.ebiom.2018.01.002

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

29. Прасанна С.Дж., Гопалакришнан Д., Шанкар С.Р., Васандан А.Б.Провоспалительные цитокины, IFNgamma и TNFalpha, по-разному влияют на иммунные свойства человеческого костного мозга и мезенхимальных стволовых клеток Wharton jelly. PLOS ONE . (2010) 5: e9016. DOI: 10.1371 / journal.pone.0009016

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

30. Райан Дж. М., Барри Ф., Мерфи Дж. М., Махон Б. П.. Интерферон-γ не разрушается, но способствует иммуносупрессивной способности мезенхимальных стволовых клеток взрослого человека. Клин Эксперимент Иммунол .(2007) 149: 353–63. DOI: 10.1111 / j.1365-2249.2007.03422.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

31. Юлостало Дж. Х., Бажанов Н., Мохаммадипур А., Бартош Т. Дж.. Производство и введение терапевтических сфероидов мезенхимальных стволовых / стромальных клеток (МСК), примированных в трехмерных культурах в условиях, свободных от ксено. Дж Vis Exp . (2017) 121: e55126. DOI: 10.3791 / 55126

CrossRef Полный текст | Google Scholar

32. Триглиа Р.П., Линскотт В.Д. Титры девяти компонентов комплемента, конглютинина и C3b-инактиватора в сыворотке взрослого и плода крупного рогатого скота. Мол Иммунол . (1980) 17: 741–8. DOI: 10.1016 / 0161-5890 (80)

-3

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

33. Коста МХГ, Макдевитт ТК, Кабрал Дж.М.С., да Силва Х.Л., Феррейра ФК. Трехмерные конфигурации мезенхимальных стволовых / стромальных клеток человека для усиления паракринного потенциала клеток в отношении процессов заживления ран. Дж. Биотехнология . (2017) 262: 28–39. DOI: 10.1016 / j.jbiotec.2017.09.020

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

34.Ylostalo JH, Bartosh TJ, Tiblow A, Prockop DJ. Уникальные характеристики мезенхимальных стромальных клеток / клеток-предшественников, предварительно активированных в трехмерных культурах в различных условиях. Цитотерапия . (2014) 16: 1486–500. DOI: 10.1016 / j.jcyt.2014.07.010

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

35. Bartosh TJ, Ylostalo JH. Получение противовоспалительных мезенхимальных стволовых клеток / клеток-предшественников (МСК) путем образования сфер с использованием метода культивирования висячей капли. Curr Протоколы стволовых клеток Biol . (2014) 28: Блок 2B.6. DOI: 10.1002 / 9780470151808.sc02b06s28

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

36. Zimmermann JA, McDevitt TC. Предварительное кондиционирование сфероидов мезенхимальных стромальных клеток для секреции иммуномодулирующего паракринного фактора. Цитотерапия . (2014) 16: 331–45. DOI: 10.1016 / j.jcyt.2013.09.004

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

38. Чиверс Дж. Э., Кембридж Л. М., Кэтли М. С., Мак Дж. К., Доннелли Л. Э., Барнс П. Дж. И др.Дифференциальные эффекты RU486 выявляют различные механизмы глюкокортикоидной репрессии высвобождения простагландина E-2. евро J Biochem . (2004) 271: 4042–52. DOI: 10.1111 / j.1432-1033.2004.04342.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

39. Срерамкумар В., Фресно М., Куэста Н. Простагландин E2 и Т-клетки: друзья или враги? Иммунол Клетки Биол . (2012) 90: 579–86. DOI: 10.1038 / icb.2011.75

CrossRef Полный текст | Google Scholar

40.Чон С, Ли Х-С, Ли Джи, Пак Джи, Ким Т-М, Шин Дж и др. Сдвиг градиента ЭМП в 3D-сфероидных МСК для активации функции мезенхимальной ниши. Научная репутация . (2017) 7: 6859. DOI: 10.1038 / s41598-017-07049-3

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

41. Burand AJ, Gramlich OW, Brown AJ, Ankrum J. Функция криоконсервированных мезенхимальных стромальных клеток с предварительным лицензированием интерферона-γ и без него зависит от контекста. Стволовая клетка . (2017) 35: 1437–9.DOI: 10.1002 / стержень.2528

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

42. Циммерманн Дж. А., Хеттиаратчи М. Х., МакДевитт ТС. Усиленная иммуносупрессия Т-клеток за счет устойчивой презентации биоактивного интерферона-γ в трехмерных конструкциях мезенхимальных стволовых клеток. Стволовые клетки, перевод, медицина, . (2017) 6: 223–37. DOI: 10.5966 / sctm.2016-0044

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

43. Ранганат С.Х., Тонг З., Леви О., Мартин К., Карп Дж. М., Инамдар М.С.Контролируемое ингибирование провоспалительного секретома мезенхимальных стромальных клеток с помощью инженерии микрочастиц. Репродукция стволовых клеток . (2016) 6: 926–39. DOI: 10.1016 / j.stemcr.2016.05.003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

44. Waterman RS, Tomchuck SL, Henkle SL, Betancourt AM. Новая парадигма мезенхимальных стволовых клеток (MSC): поляризация в провоспалительный MSC1 или иммуносупрессивный фенотип MSC2. PLOS ONE . (2010) 5: e10088. DOI: 10.1371 / journal.pone.0010088

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

46. Бен-Сассон С.З., Хогг А., Ху-Ли Дж., Вингфилд П., Чен Х, Крэнк М. и др. IL-1 усиливает экспансию, эффекторную функцию, локализацию в тканях и ответ памяти антиген-специфических CD8 Т-клеток. J Exp Med . (2013) 210: 491–502. DOI: 10.1084 / jem.20122006

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

47. Чен Х, Ган И, Ли В, Су Дж, Чжан И, Хуанг И и др.Взаимодействие между мезенхимальными стволовыми клетками и стероидами при воспалении. Смерть клетки . (2014) 5: e1009. DOI: 10.1038 / cddis.2013.537

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

48. Микело С.М., Фассе Е., ван Краненбрук Б., Линда К., ван дер Меер А., Абдельразик Х. и др. Добавлены эффекты дексаметазона и мезенхимальных стволовых клеток на раннюю активацию естественных клеток-киллеров. Транспл Иммунол . (2016) 37: 1–9. DOI: 10.1016 / j.trim.2016.04.008

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

49. Хемниц Дж. М., Дризен Дж., Классен С., Райли Дж. Л., Деби С., Бейер М. и др. Простагландин E2 ухудшает активацию CD4 + Т-клеток за счет ингибирования lck: последствия для лимфомы Ходжкина. Cancer Res . (2006) 66: 1114–22. DOI: 10.1158 / 0008-5472.CAN-05-3252

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

50. Лёвенберг М., Верхаар А.П., Бильдербик Дж., Марл Дж. В., Буттгерайт Ф., Пеппеленбош М.П. и др.Глюкокортикоиды вызывают быструю диссоциацию белкового комплекса, ассоциированного с Т-клеточным рецептором, содержащего LCK и FYN. EMBO Rep . (2006) 7: 1023–9. DOI: 10.1038 / sj.embor.7400775

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

51. Петта I, Деджер Л., Балледжер М., Ливенс С., Тавернье Дж., Де Бошер К. и др. Взаимодействие рецептора глюкокортикоидов и его влияние на действие глюкокортикоидов в борьбе с воспалительными и инфекционными заболеваниями. Микробиол Мол Биол Ред. . (2016) 80: 495–522. DOI: 10.1128 / MMBR.00064-15

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

53. Боланд Л.К., Буранд А.Дж., Бойт Д.Т., Доброски Х., Ди Л., Лишевский Ю.Н. и др. Природа против воспитания: определение влияния изоляции мезенхимальных стромальных клеток и условий культивирования на устойчивость к воздействию пальмитата. Фронт Иммунол . (2019) 10: 1080. DOI: 10.3389 / fimmu.2019.01080

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

.