Кислота янтарная действие: Янтарная кислота — инструкция по применению, дозы, побочные действия, противопоказания, цена, где купить

Церебронорм инструкция по применению: показания, противопоказания, побочное действие – описание Cerebronorm Таблетки (29930)

📜 Инструкция по применению Церебронорм 💊 Состав препарата Церебронорм ✅ Применение препарата Церебронорм 📅 Условия хранения Церебронорм ⏳ Срок годности Церебронорм Сохраните у себя Поделиться с друзьями Пожалуйста, заполните поля e-mail адресов и убедитесь в их правильности ⚠️ Срок действия регистрационного удостоверения данного продукта истёк 17.02.16 Описание лекарственного препарата Церебронорм (Cerebronorm) Основано на официально утвержденной инструкции по применению препарата и подготовлено для электронного издания справочника Видаль 2011 года, дата обновления: 2019.12.20 Владелец регистрационного удостоверения: Код ATX: N07XX (Прочие препараты для лечения заболеваний нервной системы) Лекарственная форма Церебронорм Таб., покр. кишечнорастворимой обол.: 10, 20, 60, 100 или 200 шт. рег. №: ЛП-000275 от 17.02.11 — Истекло Форма выпуска, упаковка и состав препарата Церебронорм Таблетки 1 таб. янтарная кислота 100 мг инозин (рибоксин) 100 мг никотинамид 50 мг рибофлавин 10 мг 20 шт. — упаковки ячейковые контурные (1) — пачки картонные. 10 шт. — упаковки ячейковые контурные (10) — пачки картонные. 20 шт. — банки полимерные (1) — пачки картонные. 60 шт. — банки полимерные (1) — пачки картонные. 100 шт. — банки полимерные (1) — пачки картонные. 10 шт. — упаковки ячейковые контурные (2) — пачки картонные. 10 шт. — упаковки ячейковые контурные (1) — пачки картонные. 20 шт. — упаковки ячейковые контурные (3) — пачки картонные. 20 шт. — упаковки ячейковые контурные (10) — пачки картонные. 10 шт. — упаковки безъячейковые контурные (1) — пачки картонные. Фармакологическое действие Препарат проявляет церебропротекторное, антигипоксическое, антиоксидантное и метаболическое действие, способствует синтезу в нейронах гамма-аминомасляной кислоты (ГАМК) и серотонина, ограничивает зону некроза. Фармакологическая активность препарата определяется сочетанным влиянием компонентов на выработку АТФ в митохондриях. Субстрат цикла Кребса янтарная кислота активирует сукцинатдегидрогеназу, поддерживает активность наиболее быстрого — сукцинатоксидазного пути образования макроэргов. Благодаря регуляторному эффекту янтарной кислоты снижается образование свободных радикалов, восстанавливается активность ферментов антиоксидантной защиты и энергетический потенциал клетки. Она активирует окислительно-восстановительные ферменты дыхательной цепи митохондрий, способствует утилизации глюкозы и жирных кислот, стимулирует синтез белка и нуклеиновых кислот, ресинтез макроэргов даже в условиях выраженной ишемии и гипоксии. Янтарная кислота оказывает выраженное антитоксическое действие, оказывая необходимую энергетическую поддержку системам детоксикации и элиминации. Предшественник АТФ — рибоксин оказывает антигипоксическое, метаболическое и анаболическое действие. Он облегчает утилизацию клеткой углеводов, пировиноградной кислоты, улучшает окислительные процессы благодаря активации ксантин-дегидрогеназы и ферментов цикла Кребса; эффект проявляется даже при пониженной концентрации кислорода в крови. Рибоксин повышает энергетический баланс клеток, активирует регенерацию тканей, снижает агрегацию тромбоцитов. Рибофлавин нормализует метаболические процессы митохондрий при гипоксии и повышенной потребности в АТФ, взаимодействуя с аденозинтрифосфорной кислотой и образуя флавинаденинмононуклеотид и флавинадениндинуклеотид — коферменты флавинпротеинов, обеспечивающих активность сукцинат-оксидазного комплекса и цитохро-С-редуктазы. Он способствует активации углеводного, белкового и жирового обменов, регулирует окислительно-восстановительные процессы, участвует в синтезе гемоглобина, в поддержании нормальной зрительной функции глаза. Никотинамид является коферментом НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ митохондрий, обеспечивающих окислительно-восстановительные и синтетические процессы за счет переноса водорода. Он принимает активное участие в углеводном, белковом и жировом обменах, тканевом дыхании. Никотинамид стимулирует утилизацию глюкозы, улучшает микроциркуляцию, оказывает антитоксическое и слабое антикоагулянтное действие; участвует в регуляции высшей нервной деятельности, уменьшая дефицит триптофана — предшественника нейромедиатора серотонина. Облегчая синтез в ЦНС серотонина, никотинамид снижает бессонницу, подавленность, депрессию, беспокойство, нервозность, бред, галлюцинации, способствует концентрации внимания. Препарат улучшает мозговой кровоток, метаболические процессы в центральной нервной системе, устраняет рефлекторные нарушения, расстройства чувствительности, улучшает интеллектуально-мнестические функции мозга. Фармакокинетика Все компоненты препарата хорошо всасываются в желудочно-кишечном тракте, распределяются в организме и метаболизируются. Янтарная кислота подвергается в митохондриях окислительному распаду до СО 2, который выводится с выдыхаемым воздухом. Время элиминации половины введенной дозы янтарной кислоты из организма – 0.48 ч, время достижения максимальной концентрации – 0.75 ч. При однократном приеме терапевтической дозы янтарная кислота циркулирует в крови 0.89 ч. Рибоксин метаболизируется в печени с образованием глюкуроновой кислоты и последующим ее окислением; в незначительном количестве выделяется с мочой. Cmax рибоксина в плазме достигается примерно через 1 ч; T1/2 из плазмы — около 50 мин. Рибофлавин при приеме внутрь неравномерно распределяется в организме (преимущественно поступает в миокард, печень, почки), проникает через плаценту и в молоко матери. До 60% рибофлавина связывается с белками, экскреция осуществляется почками, преимущественно в неизмененном виде, частично — в виде метаболитов. T 1/2 рибофлавина из плазмы — около 2 ч. Никотинамид при приеме внутрь быстро распределяется во все ткани; проникает через плаценту и в молоко матери. Метаболизируется в печени с образованием никотинамида-N-метилникотинамида. Экскреция осуществляется почками. T1/2 из плазмы составляет 1.3 ч. Показания препарата Церебронорм В комплексной терапии: хронической недостаточности мозгового кровообращения; восстановительный период ишемических нарушений мозгового кровообращения; энцефалопатии различной этиологии (печеночная, алкогольная энцефалопатия и др.). Режим дозирования Назначают взрослым по 1 таблетке 3 раза в сут после еды. Курсы лечения по 4-6 недель, повторяют 2-3 раза в год. Высшая суточная доза препарата — 5 таблеток. Побочное действие Обычно препарат хорошо переносится, не вызывает привыкания, является не токсичным. В случае индивидуальной непереносимости компонентов препарата возможны аллергические реакции: сыпь, зуд и покраснение кожных покровов. Противопоказания к применению индивидуальная непереносимость компонентов препарата; женщины в период беременности и лактации; детям до 18 лет в виду отсутствия клинических данных о применении препарата в педиатрии; мочекаменная болезнь; подагра. Применение при беременности и кормлении грудью Противопоказан в период беременности и лактации. Применение при нарушениях функции почек Противопоказан при мочекаменной болезни. Во время лечения возможно ухудшение функции почек. Применение у детей Противопоказан детям до 18 лет в виду отсутствия клинических данных о применении препарата в педиатрии. Особые указания Может изменять цвет мочи (окрашивает мочу в светло-желтый или темный цвет). Препарат может способствовать повышению концентрации мочевой кислоты в крови и вызвать обострение подагры. Возможно нарушение зрения, ухудшение функции почек. Передозировка Возможно появление: гиперемии кожных покровов, чувства онемения, жжения или покалывания. Лекарственное взаимодействие Янтарная кислота хорошо сочетается со всеми лекарственными препаратами, снижает их побочное токсическое действие. Рибофлавин уменьшает активность доксициклина, тетрациклина, окситетрациклина, эритромицина и линкомицина; не совместим со стрептомицином. Хлорпромазин, имипрамин, амитриптилин за счет блокады флавинокиназы нарушают включение рибофлавина в флавинаденинмононуклеотид и флавинадениндинуклеотид и увеличивают его выведение с мочой. Этанол, трициклические антидепрессанты, фенотиазины, препараты, блокирующие канальцевую секрецию, снижают абсорбцию и замедляют метаболизм рибофлавина. М-холиноблокаторы увеличивают всасывание и биодоступность за счет снижения перистальтики кишечника. Тиреоидные гормоны, ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента ускоряют метаболизм рибофлавина. Одновременное назначение с противоопухолевым препаратом метотрексатом снижает активность рибофлавина. Рибофлавин уменьшает и предупреждает побочные эффекты хлорамфеникола (нарушение гемопоэза, неврит зрительного нерва). Инозин усиливает действие антиаритмических, антиангинальных и инотропных лекарственных препаратов. Никотинамид усиливает действие фибринолитических, спазмолитических, гипотензивных средств, сердечных гликозидов, ацетилсалициловой кислоты, уменьшает всасывание секвестрантов желчных кислот. Условия хранения препарата Церебронорм В сухом, защищенном от света и недоступном для детей месте, при температуре не выше 25°С. Сроки годности. 2.5 года. Не использовать после истечения срока годности, указанного на упаковке. Условия реализации Препарат отпускается по рецепту. Сохраните у себя Поделиться с друзьями Пожалуйста, заполните поля e-mail адресов и убедитесь в их правильности

Янтарная кислота-Марбиофарм 0,1г таблетки 0,5г 10 шт (БАД)

Краткое описание

В качестве биологически активной добавки к пище — источника янтарной кислоты.

Состав

• кислота янтарная,
• сахар,
• крахмал картофельный,
• тальк,
• кальция стеарат,
• аэросил.

Фармакологическое действие

Препарат положительно влияет на работу всех систем органов в целом, поскольку улучшает клеточное питание и ускоряет насыщение тканей кислородом.
Также добавка способствует:

1. Стимуляции работы головного мозга.
2. Ускорению расщепления токсинов в печени и их выведению из тела.
3. Снижению риска развития опухолей.
4. Повышению сопротивляемости организма бактериям и вирусам.
5. Уменьшению выраженности аллергических реакций.
6. Снятию повышенной раздражительности.
7. Нормализации сна.

Для достижения терапевтического эффекта достаточно принимать по одной таблетке в день.
Производство осуществляется в соответствии со всеми действующими санитарно-гигиеническими стандартами, благодаря чему добавка безопасна для человека при приеме в дозах, указанных на официальном сайте. Однако перед применением рекомендуется проконсультироваться со специалистом.

Показания

В качестве биологически активной добавки к пище — источника янтарной кислоты.

Способ применения и дозировка

Взрослым — по 1 таблетке 2 раза в день во время еды.

Побочные действия

Аллергические реакции

Противопоказания

• индивидуальная непереносимость компонентов,
• беременность,
• кормление грудью,
• язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки,
• мочекаменная болезнь,
• выраженная артериальная гипертензия.

Перед применением рекомендуется проконсультироваться с врачом.

Передозировка

как принимать, показания к применению

Во время употребления алкогольных напитков происходит накопление в организме этанола – главной составляющей этилового спирта. Через определенный промежуток времени он начинает распадаться, образуя органическое соединение ацетальдегид, которое оказывает токсическое воздействие и наступает отравление организма, более известное в народе как похмелье. Требуется время, чтобы печень смогла нейтрализовать все токсины и вывести их из организма. Существуют эффективные средства, получившие положительные отзывы, которые позволяют ускорить данный процесс, одно из них – янтарная кислота.

Янтарная кислота как средство от похмелья

Организм человека спокойно сам вырабатывает янтарную кислоту, но главная ее особенность: она не накапливается, а мгновенно расходуется, так как участвует во многих процессах. Янтарная кислота помогает от похмелья благодаря сукцинатом, которые эффективно выводят шлаки. Сукцинаты – соли янтарной кислоты, обладающие превосходными антиоксидантными свойствами.

В сутки организм человека способен выработать до 200 мг янтарной кислоты, но этого количества недостаточно, чтобы максимально эффективно нейтрализовать ацетальдегид. Помимо выведения токсинов в приоритете также: выработка секреции инсулина, нормализация обмена веществ, защита организма от проникновения инфекций, стимуляция выработки серотонина.

Польза и вред янтарной кислоты

Таблетки янтарная кислота от похмелья способны мгновенно насытить клетки печени кислородом, в результате чего в разы увеличивается ее эффективность, а значит и скорость вывода токсинов. Но не только для этого принимают это вещество. Янтарная кислота ценится также за то, что:

• участвует в метаболических реакциях;
• крайне необходима для ионного транспорта и клеточного дыхания;
• безе нее невозможен синтез белков и выработки внутриклеточной энергии;
• служит иммуномодулятором;
• способна усилить действие других препаратов;
• стимулирует окислительные процессы;
• снижение риска формирования злокачественных опухолей и торможение их роста.

Янтарная кислота с первого взгляда может показаться волшебным средством практически от всех болезней, но и она может нанести вред организму человека. В первую очередь, она агрессивно воздействует на желудок, поэтому страдающим язвой или эрозиями пищеварительного тракта категорически запрещено употреблять препарат. Плюс, стоит серьезно задуматься перед применением янтарной кислоты людям, которые страдают гипертонией, так как она способствует повышению давления.

Инструкция по применению янтарной кислоты

Существует несколько вариантов выпуска янтарной кислоты в фармацевтической промышленности: таблетки, порошок, капсулы и растворы для инъекции. Наиболее распространенный и удобный вариант —  в таблетках по 100 мг активного вещества. Существует ряд нюансов, которые необходимо учитывать, чтобы не навредить себе и добиться максимального эффекта от препарата. Янтарная кислота при похмелье в форме таблеток должна применяться крайне осторожно из-за воздействия на слизистую желудка. Именно поэтому рекомендовано таблетку рассасывать, а не проглатывать целиком.

Оптимальной дозой для устранения всех продуктов распада этанола, вызывающих похмелье, для взрослого человека составляет 600-700 мг янтарной кислоты в течение суток. Именно поэтому выработана схема приема БАДа по одной таблетке, которая содержит 100 мг через каждый час. Данная технология позволяет поддерживать окислительный процесс на протяжении длительного периода, что способствует быстрому выводу ацетальдегидов, которые и вызывают отравление.

Также существует и методика приема янтарной кислоты перед употреблением алкоголя, чтобы уменьшить глубину опьянения за счет ускоренного метаболизма. Сколько принимать, зависит от продолжительности застолья, но стоит помнить, что эффект от препарата длится максимум 2,5 часа. Чаще всего стандартной формой превентивных методов является прием  двух таблеток (200 мг) за 40 минут до начала застолья.

Янтарная кислота показания при похмелье

У каждого человека организм по-разному реагирует на интоксикацию алкоголем.  Но существует ряд обобщенных признаков, что вы испытываете похмелье и стоит позаботиться о помощи своему телу:

1. Головная боль и головокружение.
2. Повышенная чувствительность к звуку и свету.
3. Небольшой озноб и общая слабость.
4. Слегка повышенная температура тела.
5. Сильная жажда.
6. Повышенная потливость.
7. Мелкое дрожание рук (тремор).

Все это ярко выраженные признаки отравления организма продуктами распада этанола. Пока не выведутся ацетальдегиды при помощи работы печени, вы будете себя чувствовать разбитым, уставшим и немощным. Янтарная кислота не только снабдит печень кровью с повышенным содержанием кислорода, что ускорит ее работоспособность, но и приведет вас в тонус, за счет насыщения клеток дополнительной энергией.

Противопоказания к применению янтарной кислоты

Как принимать янтарную кислоту при похмелье мы выяснили, теперь настало время узнать, когда не рекомендовано употребление, в силу специфичности препарата. Выявлено, что при применении янтарной кислоты организм несколько взбадривается, поэтому нельзя совмещать ее с глицином и транквилизаторами, которые имеют абсолютно противоположный эффект.

Янтарная кислота после похмелья может приниматься и в профилактических целях, но стоит четко понимать, что употребление ее совместно с сорбентами (активированный уголь) – пустая трата времени, так как они нейтрализуют действия препарата и просто выводят ее из организма. Также недопустимо совмещать кислоту с содой, так как между ними возникает бурная реакция с выделением соли натрия. Так как янтарная кислота усиливает действие препаратов, во избежание передозировки рекомендуется выждать не менее получаса при совместном приеме с мезимом и магнезией.

Страдающим гастритом, мочекаменной болезнью, гипертонией и язвами рекомендуется проконсультироваться со специалистами перед назначением себе курса приема янтарной кислоты, также наблюдались случаи индивидуальной непереносимости.

Янтарная кислота. Свойства, особенности, сфера применения

Янтарная кислота

CAS номер: 110-15-6
Брутто формула: C4H6O4
Внешний вид: порошок белого цвета
Химическое название и синонимы: Succinic acid, Butanedioic acid; 1,2-Ethanedicarboxylic acid; Amber acid
Физико-химические свойства:
Молекулярная масса 118.09 г/моль
Температура плавления 185-190 °С
Температура кипения 235 ºC
Растворимость в воде: частично растворима в холодной воде 80 г / л (20 ºC)
Удельный вес: 1,56 (вода = 1)
Воспламеняемость субстанции: Может быть горючим при высокой температуре.
Продукты сгорания субстанции: эти продукты представляют собой оксиды углерода (CO, CO2).

Описание:

Янтарная кислота или бутандиовая кислота представляет собой дикарбоновую кислоту, состоящую из четырех атомов углерода и встречающуюся в растительных и животных тканях. Янтарная кислота по физическому состоянию является твердыми кристаллами без запаха, она растворима в воде и имеет кисловатый вкус. Она растворяется в воде, слегка растворяется в этаноле, эфире, ацетоне и глицерине. Succinic acid не растворяется в бензоле, сульфиде углерода, четыреххлористом углероде или масляном эфире. Янтарная кислота может давать ацилгалогениды, ангидриды, сложные эфиры, амиды и нитрилы для применения в медицинских средствах, сельском хозяйстве, пищевых продуктах и ​​других отраслях.

Эта четырехатомная дикарбоновая кислота используется во множестве отраслей промышленности, включая полимеры (волокна одежды), продукты питания, ПАВ и другие вещества, ароматизаторы.

Химическое вещество играет важную роль в промежуточном метаболизме или в цикле Кребса в организме. Янтарная кислота широко распространена в природе, где она содержится даже в пластинчатожаберных морских организмах, водорослях, лишайниках, бактериях и т. д. Она была впервые выявлена в середине 16 века, когда доктор Георгий Агрикола в Германии «перегонял» янтарь. Янтарная кислота не токсична, стабильна и безвредна для человеческого организма. Она образуется в цикле лимонной кислоты и янтарном кислотно-глициновом цикле через процесс метаболизма и в результате чего образуется энергия.

Применение:

Субстанцию янтарной кислоты часто применяют для производства ароматических средств, используют для продуктов питания и напитков. Широко находит применение в химической промышленности: в производстве лакокрасочных изделий, красителей, алкидных смол, полимеров и других химических веществ. Янтарная кислота, которая используется в качестве химического промежуточного продукта, в медицине, производстве лаков и для производства эфиров духов. Он также используется в пищевых продуктах в качестве секвестранта, буфера и нейтрализующего агента.

Является исходным веществом в процессе синтеза некоторых важных химических веществ, например из нее, можно получить адипиновую кислоту, N-метилпирролидинон, 2-пирролидинон, сукцинатные соли, 1,4-бутандиол, малеиновый ангидрид, тетрагидрофуран и гамма-бутиролактон, которые используются в фармацевтической промышленности.

Янтарная кислота имеет много применений в фармацевтической промышленности – например, она является исходным материалом для активных фармацевтических ингредиентов (API), в качестве добавки в составе, моноэтиловый эфир янтарной кислоты использовали в качестве инсулинотропного агента и соединение также используется в качестве сшивающего агента в полимерах, контролирующих лекарственное средство. В медицине янтарная кислота часто входит в состав некоторых лекарственных средств, таких как седативные средства, спазмолитики, НПВС, контрацептивные средства и даже в онкологии.

Как и молочная кислота, и 1,3-пропандиол, янтарная кислота может быть использована в качестве мономера для синтеза полимера. Ферментативное же производство янтарной кислоты из возобновляемых ресурсов приобрело большой интерес в последние несколько лет.

Выброс в окружающую среду этого вещества может происходить в процессе промышленного использования: в качестве промежуточной стадии в дальнейшем производстве другого вещества (использование промежуточных продуктов), в технологиях переработки на промышленных объектах, в производстве изделий, для производства термопластов и в качестве вспомогательного средства для обработки.

Получение: 

Химическое вещество также известно как «Дух янтаря». Когда оно было впервые обнаружено, его экстрагировали из янтаря путем измельчения и отгонки с использованием песчаной ванны.

Сегодня янтарная кислота генерируется для использования человеком синтетически или превращается из биомассы путем ферментации. Общие промышленные пути синтеза включают частичное гидрирование малеиновой кислоты, окисление 1,4-бутандиола и карбонилирование этиленгликоля. Кроме того, генетическая инженерия микроорганизмов, таких как Escherichia coli или Saccharomyces cerevisiae, недавно позволила производить коммерческую продукцию при ферментации глюкозы. Мировое производство оценивается в 16 000-30 000 тонн в год, с ежегодным темпом роста 10%.

Многие метаболически модифицированные бактерии E.coli были разработаны как более благоприятные организмы для ферментативного производства янтарной кислоты из глюкозы. В анаэробных условиях E. coli продуцирует смесь органических кислот, включая янтарную кислоту . Для увеличения производства янтарной кислоты были изучены многие подходы к метаболической инженерии и мутации, в том числе:

1) сверхэкспрессирующий нативный фосфоенолпируват (PEP) карбоксилаза для направления большего количества пирувата в янтарную кислоту

2) сверхэкспрессию фумаратредуктазы для дальнейшего улучшения конверсии фумарата

3) инактивации генов пирувата формиата лиазы (pfl) и лактатдегидрогеназы (ldhA) для закрытия конкурирующих путей при сверхэкспрессии яблочного фермента.

4) введение гетерологичных генов для пируваткарбоксилазы (pyc) для увеличения доступности оксалацетата

5) инактивации гена ptsG и системы глюкозофосфотрансферазы (PTSG) для увеличения доступности фосфоенолпирувата .

У штамма E.coli с мутациями в pfl, ldhA, pyc и ptsG удалось продуцировать янтарную кислоту из глюкозы с высокой конечной концентрацией (99,2 г / л), продуктивностью (1,3 г / л) и выходом (1,1 г / г ) в двухфазной (аэробной для роста клеток с последующим анаэробным для производства) ферментации с использованием сложной среды, содержащей дрожжевой экстракт и триптон. Выход сукцината(анион янтарной кислоты) выше 1,0 г / г, вероятно, обусловлен включением СО2 и дополнительными источниками углерода, присутствующими в сложной среде.

Ферментативное производство янтарной кислоты рекомбинантной E. coli ограничено кофактором NADH и плохим ростом клеток и медленным образованием в анаэробных условиях [97, 98]. Была разработана система производства аэробных сукцинатов, которая позволяет E. coli производить и накапливать сукцинат в аэробных условиях. Множественные мутации в цикле трикарбоновой кислоты (sdhAB, icd, iclR) и ацетатные пути (poxB, ackA-pta) перенаправляют поток углерода к янтарной кислоте через два пути:

1) цикл глиоксилата, когда icd также выбивается, и 2) окислительная ветвь цикла TCA, когда icd не выбивается. Выпадение sdhAB позволяет накопить сукцинат у мутантов, который обычно не происходит в E. coli в аэробных условиях. При инактивации ptsG и сверхэкспрессии устойчивой к пират-карбоксилазе ингибирования малатной обратной связи мутанты способны вырабатывать максимальный теоретический выход сукцината в 1,0 моль / моль (0,66 г / г), потребляемой глюкозой. Это первая аэробная сукцинатная система производства, основанная на создании новой аэробной центральной метаболической сети в E. coli .Однако производительность сукцината была низкой, менее 0,27 г / л-ч, а также было существенное накопление промежуточных продуктов цикла пирувата и ТСА цикла С6 в ферментации. Для этой системы необходимо сделать больше усовершенствований в области метаболической инженерии, чтобы сделать производство аэробного сукцината более эффективным и экономичным.

Действие на организм:

Субстанция принимает участие в важнейшем для организма цикле Кребса. Цикл Кребса представляет собой последовательный процесс ферментативной реакции, в котором янтарная кислота последовательно в 3 этапа превращается в четырёхуглеродный оксалоацетат, для обеспечения энергии в виде высокоэнергетических фосфатных связей.

Янтарная кислота способна доставлять электроны в цепочку переноса электронов. Сукцинатдегидрогеназа (SDH) играет важную роль в митохондриальной функции, являясь как частью дыхательной цепи, так и цикла Кребса. SDH с ковалентно прикрепленной протезной группой FAD, способна связывать несколько различных субстратов фермента (сукцинат и фумарат) и физиологические регуляторы (оксалоацетат и АТФ). Окисляющий сукцинат связывает SDH с циклом быстрого цикла Krebs, где он участвует в расщеплении ацетил-CoA в течение всего цикла Кребса. Сукцинат может быть легко импортирован в митохондриальную матрицу с помощью н-бутилмалонат- (или фенилсукцинат-) чувствительного дикарбоксилатного носителя в обмен с неорганическим фосфатом или другой органической кислотой. Мутации в четырех генах, кодирующих субъединицы митохондриальной сукцинатдегидрогеназы, связаны с широким спектром клинических проявлений, то есть с заболеванием Хантингтона . Более того, считается, что янтарная кислота связана с D-2-гидроксиглутаровой кислой, что является врожденной ошибкой метаболизма. Янтарная кислота недавно была идентифицирована как онкометаболит или эндогенный, вызывающий рак метаболит. Высокие уровни этой органической кислоты можно найти в опухолях или биожидкостях, окружающих опухоли. Его онкогенное действие, по-видимому, связано с его способностью ингибировать ферменты, содержащие пролилгидроксилазу. Во многих опухолях доступность кислорода становится очень ограниченной (гипоксия) очень быстро из-за быстрой пролиферации клеток и ограниченного роста кровеносных сосудов. Основным регулятором реакции на гипоксию является фактор транскрипции HIF (HIF-альфа). При нормальном уровне кислорода уровни белка HIF-альфа очень низки из-за постоянной деградации, опосредуемой серией событий после трансляционной модификации, катализируемых ферментами PHD1, 2 и 3, содержащими домен, пролилгидроксилазы (также известный как EglN2, 1 и 3), что гидроксилат HIF-альфа и приводит к его деградации. Все три фермента PHD ингибируются сукцинатом.

Было показано, что янтарная кислота также является хорошим «естественным» антибиотиком из-за ее относительной кислотной или каустической природы (высокие концентрации могут даже вызывать ожоги). Показано, что сукцинатные добавки помогают уменьшить эффекты похмелья, активируя деградацию ацетальдегида — токсического побочного продукта алкогольного обмена — в CO2 и h3O через аэробный обмен. Показано, что янтарная кислота стимулирует восстановление нервной системы и укрепляет иммунную систему. Утверждалось также, что она повышает осведомленность, концентрацию и рефлексы.

Янтарная кислота обладает особыми свойствами, которые снимают стресс и беспокойство. Улучшает клеточное дыхание.

Недавние исследования показали, что способность янтарной кислоты улучшать клеточное дыхание, а также метаболизм глюкозы, которые позволяют организму функционировать оптимально. Когда клетки способны принимать кислород и использовать его для получения энергии.

Токсикологические данные:

При оральном применении (LD50): Острая токсичность: 2260 мг / кг [крыса].

где и как хранить, показания к применению

Биологически активная добавка Янтарная кислота назначается пациентам, как источник сукцинатов.

Содержание:

Состав препарата

Активно действующим веществом фармацевтического средства является янтарная кислота. Среди дополнительных компонентов выделяют:

Янтарная кислота некоторыми фармацевтическими компаниями выпускается в комбинации с аскорбинкой.

Лекарственная форма выпуска

Препарат производится в виде таблеток:

• 0, 1 г

• 0, 25 г

• 0, 5 г.

В упаковке могут содержаться от 20 до 100 штук добавки.

Фармакологическое действие

Препарат способен оказывать антиоксидантный, метаболический эффект.

Фармакодинамика, фармакокинетика

Препарат Янтарная кислота обеспечивает энергосинтезирующую функцию. Активно действующее вещество стремительно биотрансформируется в фумаровую кислоту и после в другие продукты обмена веществ. Трансформация происходит под воздействием сукцинатдегидрогенезов и коэнзима.

Итоговыми продуктами распада янтарной кислоты является вода с углекислым газом.

Тканевое дыхание улучшается благодаря активации дыхательной цепи митохондрий.

Благодаря употреблению Янтарной кислоты происходит клеточное омоложение кожи.

Плюсы Янтарной кислоты:

• Повышает диастолическое артериальное давление

• Улучшает физическую работоспособность

• повышает образование хлористоводородной кислоты и секреторную функцию желез

• способствует улучшению аппетита

• запускает адаптационные, защитные функции организма

• уменьшает токсичное воздействие этанола (так как очищает организм от ядовитых веществ)

Благодаря вышеперечисленным свойствам, препарат широко используется в медицинских целях.

После перорального приема Янтарная кислота (ЯК) за полчаса распадается на конечные продукты метаболизма.

Показания к применению

Врачи назначают препарат при функциональной астении. Употребление Янтарной кислоты поможет избавиться от головной боли, к которой привели проблемы с питанием мозговых клеток. Кроме того средство помогает избавиться от повышенной утомляемости и забывчивости.

Доктора советуют использовать препараты ЯК в качестве дополнительной терапии при патологиях сердечно-сосудистой системы.

Янтарная кислота повышает эффективность медикаментов основной терапии. Кроме того ЯК улучшает качество волос и кожи, ее часто рекомендуют косметологи своим пациентам.

Когда еще назначается:

• при алкогольном или лекарственном отравлении

• для терапии церебрального атеросклероза и дисциркуляторной энцефалопатии (как вспомогающее средство)

• при патологиях опорно-двигательной системы (как компонент комплексной терапии)

• при бронхолегочных болезнях (способствует улучшению самочувствия и увеличения длительности ремиссии)

• при респираторных заболеваниях

• при онкологии

• в профилактических целях

Янтарная кислота для похудения

Таблетки могут помочь и для избавления от лишнего веса. Почему можно похудеть, принимая Янтарную кислоту:

• хорошо очищает организм

• выводит излишки жидкости

• улучшает деятельность пищеварительной системы

Противопоказания к приему Янтарной кислоты

Сукцинаты являются естественными для организма веществами, поэтому их прием даже длительное время не вызывает негативных проявлений и привыкания.

Однако таблетки Янтарной кислоты, как и многие препараты, имеют ряд противопоказаний:

1. глаукома

2. гестоз беременных (в частности тяжелая форма)

3. повышенное кровяное давление

4. уролитиаз (прием ЯК провоцирует быстрое образование конкрементов)

5. гастрит с гиперсекрецией

6. обострение язвенной болезни

Таблетки Янтарной кислоты не нужно употреблять в вечерние часы, так как они оказывают воздействие противоположное транквилизаторам, успокоительным. Препарат запускает работу головного мозга.

Побочные действия

При артериальной гипертензии прием БАД может стать причиной повышения артериального давления. Кроме тог, побочными эффектами может выступать:

Инструкция по применению

В аннотации указано, что Янтарную кислоту необходимо принимать до приема пищи, таблетки необходимо растворить в минеральной воде либо в соке.

В сутки взрослым можно принимать от 0, 5 до 3 таблеток. Продолжительность терапии приравнивается к 1 месяцу.

Для предотвращения отравления продуктами распада этанола необходимо до приема спиртного за 30 минут употребить 0.25 г Янтарной кислоты.

Для улучшения аппетита принимают 0,25 г вещества 1-3 раза в сутки до еды.

При раковых заболеваниях больным назначают 2-3 таблетки 0. 1г. Если возникнет необходимость, дозировку увеличивают до 20 штук за день.

Передозировка

Передозировка таблетками Янтарной кислоты практически не встречается.

Взаимодействие

Биологически активная добавка совместима со многими медикаментами. Однако ЯК понижает эффективность барбитуратов и анксиолитиков.

Препарат часто используется в качестве вспомогательного средства при инфекционных болезнях. Оно помогает снизить токсичность других медикаментов.

Условия продажи

Для приобретения Янтарной кислоты рецепт от лечащего врача не потребуется.

Где и как хранить

Препарат можно хранить при температуре не выше 25 градусов, в труднодоступном для детей месте.

Срок годности

После выпуска препарат можно использовать 4 года.

Янтарная кислота и этиловый спирт

После употребления спиртное преобразуется в токсичное вещество. Прием добавки помогает ускорить расщепление ядовитого вещества на менее токсичные для организма соединения. Кроме того, препарат Янтарная кислота улучшает самочувствие, ускоряет очищение организма.

Таблетки целесообразно употреблять:

Лечение Янтарной кислотой более 1 месяца допустимо после прохождения полной диагностики здоровья, назначения доктором.

Янтарная кислота для сельскохозяйственных птиц

Кормовая компания Мегамикс Контакты:

Адрес: ул. Б.Грузинская, д. 61, стр.2 123056 г. Москва Телефон: (495) 123-34-45 Электронная почта: [email protected] 55.772386,37.584479

Адрес: п. Первомайский, промышленная зона 040706 Республика Казахстан, Алматинская обл. Телефон: +7 (727) 299-39-99 Электронная почта: [email protected] 44.800584,78.1726

Адрес: ул.Городецкая 38А, офис 16 220125 Республика Беларусь, г. Минск Телефон: +7 (017) 361-60-61, 361-60-62 Электронная почта: [email protected] 53.78897,27.977427

Адрес: Гипрозем 16 734067 Республика Таджикистан, г.Душанбе Телефон: +9 (22) 372-31-08-63 Электронная почта: [email protected] 41.285265,69.309687

Адрес: ул. Фаргона йули, 23 100005 Республика Узбекистан, г.Ташкент Телефон: +998 (71) 291-62-49 Электронная почта: [email protected] 41.285265,69.309687

Адрес: ул.Добролюбова, 53/4 офис35 г. Ставрополь Телефон: +7(8652)99-70-17 Электронная почта: [email protected] 45.037088,41.990607

Адрес: пер. Почтовый, д. 9 460000 г. Оренбург Телефон: +7 (8442) 97-97-97 доб. 181 Электронная почта: [email protected] 51.760596,55.108337

Адрес: ул.Нальчикское шоссе,13 Ставропольский край, Пятигорск Телефон: +7-926-029-79-00 Электронная почта: [email protected] 44.00935,43.104312

Адрес: Ракитянский р-он, ул. Пролетарская, д. 2А. 309310 Белгородская обл., п. Ракитное Телефон: +7 (8442) 97- 97- 97 доб. 496 Электронная почта: [email protected] 50.834087,35.834156

Адрес: ул. Куйбышева, 1 Челябинская область, г.Коркино Телефон: +7 (8442) 97-97-97 доб. 491 Электронная почта: [email protected] 54.900808,61.396526

Адрес: ул. Дорожная, 5г 399540 Липецкая область, с. Тербуны Телефон: +7 (8442) 97-97-97 доб.432 Электронная почта: [email protected] 52.123517,38.273675

Адрес: пос. Новофедоровское, д.Кузнецово, а/д «Украина», 60 км 108805 г. Москва Телефон: +7 (495)122-23-70 Электронная почта: [email protected] 55.454195,36.949652

Адрес: пл. А.Невского, д. 2, БЦ Москва, оф. 1108 191167 г. Санкт-Петербург Телефон: +7 (8442) 97-97-97 доб. 172 Электронная почта: [email protected] 59.924697,30.386157

Адрес: ул. Хрустальная, д. 107, оф.1 400123 г. Волгоград Телефон: (8442) 97-97-97 Электронная почта: [email protected] 48.793832,44.534699

побочные действия препаратов, поротивопоказания к применению янтарной кислоты

Хотя янтарная кислота (сукцинат) является достаточно безопасным препаратом и крайне редко вызывает нежелательные реакции, некоторые противопоказания к её применению всё же существуют. Они обусловлены либо индивидуальной непереносимостью компонентов, находящихся в янтарной кислоте, либо физиологическим действием лекарства.

Противопоказания и побочные действия янтарной кислоты

Во-первых, основным противопоказанием к применению янтарной кислоты и препаратов на её основе является индивидуальная непереносимость, поскольку приём янтарной кислоты у людей с её непереносимостью может спровоцировать развитие аллергических реакций.

Во-вторых, поскольку янтарная кислота ускоряет метаболизм, она может в определённой степени способствовать ускорению процессов камнеобразования в мочевыводящих путях. В связи с этим янтарную кислоту противопоказано применять при уролитиазе (мочекаменная болезнь).

В-третьих, янтарная кислота(а точнее, ее соли) снижает pH (закисляет) среду, вследствие чего можно говорить и об излишнем раздражающем действии на слизистые оболочки, в том числе на слизистую желудочно-кишечного тракта;вот потому регулярный приём янтарной кислоты может спровоцировать обострение гастрита, язвенной болезни желудка или двенадцатиперстной кишки.

В-четвертых, янтарная кислота оказывает на организм стимулирующее и тонизирующее действие, в связи с чем её применение может спровоцировать возникновение таких побочных эффектов, как некоторое повышение артериального давления, что может неблагоприятно сказаться на состоянии людей с артериальной гипертензией. По той же причине янтарную кислоту нежелательно принимать при психических расстройствах и состояниях, сопровождающихся повышенной возбудимостью. В число противопоказаний, относящихся к янтарной кислоте, входят маниакальные состояния, депрессивные состояния, сопровождающиеся суицидальными мыслями, бессонница. Если человек страдает различными расстройствами, сопровождающимися повышенной тревожностью, например, генерализованным тревожным расстройством или паническими атаками, то янтарной кислоте тоже придется сказать «нет».

Янтарная кислота при беременности

Наконец, с осторожностью янтарную кислоту следует принимать при беременности, и только под контролем врача, поскольку реакция на приём препарата может быть непредсказуема. В любом случае перед применением янтарной кислоты следует внимательно прочитать инструкцию к препарату и, если есть необходимость, проконсультироваться со специалистом.

Янтарная кислота — обзор

2 От последовательной к циклической организации

Люди обычно представляют причинно-следственные процессы как связанные с воздействием одной сущности на другую: камень повреждает машину, ударяясь о лобовое стекло, или одна молекула катализирует реакцию, которая изменяет другую молекулу (например, окисляя его или добавляя к нему фосфатную группу). Обратите внимание, что часто происходят изменения в объекте, который считается причиной, а также в затронутом — камень может расколоться при ударе об автомобиль — но это, как правило, минимизируется, поскольку мы обычно концептуализируем изменение.Более того, когда задействовано несколько шагов, мы склонны концептуализировать их как выполняющиеся последовательно. Человеческое производство фокусируется на добавлении одного компонента к частично построенному объекту (как на сборочной линии) и обычно предполагает, что уже установленные компоненты не изменяются в процессе.

Это пристрастие к простой организации ясно проявилось в исследованиях алкогольного брожения, биохимического процесса, необходимого пивоварам, который превращает глюкозу в спирт и углекислый газ.Химический состав глюкозы (C ₆ H ₁₂ O ₆ в современной символике) и спирта (этанол, C ₂ H ₅ OH) был известен к началу 19 ^-го века. когда предполагалось, что брожение — обычная химическая реакция. Открытие в 1830-х годах дрожжей и их роли в ферментации подняло вопрос о том, является ли ферментация процессом, осуществляемым только в целых живых клетках. Пастер энергично отстаивал эту позицию, а также установил, что брожение происходит только в анаэробных условиях.Убедительное доказательство того, что живые клетки не нужны, наконец, появилось в 1897 году, когда Бюхнер произвел ферментацию экстрактов, полученных путем измельчения и фильтрации дрожжевых клеток. Поскольку эти химические супы содержали большое количество молекул, а также субклеточных органелл, успех Бюхнера вызвал новый вопрос: какой компонент (компоненты) клеток, удерживаемый в бесклеточных экстрактах, может быть ответственным за ферментацию?

Бюхнер предложил ответ, который иллюстрирует общий начальный шаг в объяснении явления: приписать его единственному компоненту, когда на самом деле ответственным является более сложный, многокомпонентный механизм.Соответственно, Бюхнер предположил, что гипотетический фермент, названный им , зимаза , действующий на глюкозу, объясняет ферментацию. (К тому времени ферменты были охарактеризованы как химические катализаторы внутри клеток, и для их обозначения использовался суффикс — ase ). Однако другие исследователи утверждали, что ферментация включает несколько реакций, каждая из которых катализируется разными ферментами, и собрали доказательства, указывающие на различные возможные промежуточные звенья. В течение следующих тридцати лет они соединили вместе реакции, включающие фосфорилирование, дефосфорилирование и окисление, а также внутренние реорганизации и расщепление шестиуглеродной молекулы на две трехуглеродные.Те же реакции (за исключением последней, в которой пируват превращается в спирт) были ответственны за аэробный и анаэробный гликолиз. ⁴ Рисунок 1 иллюстрирует, как биохимики, открывшие этот гликолитический путь, концептуализировали его как последовательность реакций — простейшую возможную временную схему организации. Вовлечение АТФ и НАД также подвергалось минималистической обработке, поскольку побочные реакции усиливались по линейному позвоночнику.

Рисунок 1. Гликолиз представлен как последовательность химических реакций

В контексте окислительного метаболизма (который требует аэробных условий) пируват не превращается в этанол, а, скорее, поглощается другой системой реакций для дальнейшей катаболизации до вода и углекислый газ.Исследователи, сосредоточившие внимание на этой системе, придерживались той же стратегии, что и для гликолиза, стремясь идентифицировать последовательность молекулярных промежуточных соединений между исходным субстратом и конечным продуктом. Как и раньше, каждый промежуточный продукт предполагался продуктом одной реакции и субстратом следующей, чтобы заполнить последовательность. Следуя описанию Виландом окислительных реакций как связанных с удалением и переносом пар атомов водорода либо к кислороду, либо к другому акцептору водорода, Тунберг [1920] предложил последовательность реакций, некоторые с участием окисления, которые привели от янтарной кислоты к уксусной кислоте ( с пировиноградной кислотой в качестве промежуточного продукта, а не в качестве входящего продукта гликолиза из-за фрагментарного знания обоих путей в настоящее время):

Янтарная кислота → фумаровая кислота → яблочная кислота → щавелевоуксусная кислота → пировиноградная кислота → уксусная кислота

В этот момент Тунберг столкнулся с проблемой, поскольку удаление двух атомов водорода из уксусной кислоты не привело бы к получению известного химического соединения.Его решение заключалось в том, чтобы предположить, что две молекулы уксусной кислоты соединятся; в этом процессе каждый отдает атом водорода, давая янтарную кислоту. Таким образом, необходимость заставила Тунберга замкнуть последовательность реакций, для которых он имел прямые доказательства, в цикл, но последствия были глубокими: циклическая система реакций помогает пополнить запасы своего собственного исходного субстрата. Как оказалось, первые три реакции и общее утверждение о циклической организации выдержали испытание временем, но только в знаменательной публикации Кребса и Джонсона [1937] хорошее, хотя и неполное, описание этого метаболического пути было достигнуто.На рисунке 2 сравниваются эти два предложения. Можно видеть, что исходный субстрат — субстрат, который пополняется на каждом этапе цикла, когда внутренний продукт вступает в реакцию с поставляемым извне продуктом гликолиза — на самом деле является цитратом (лимонной кислотой), а не янтарной кислотой, как в предложении Тунберга. ⁵

Рис. 2. Два описания ключевого пути окислительного метаболизма, распознающего его циклическую организацию. Справа — ранняя версия цикла Кребса, которая была по существу правильной, хотя и неполной.Его циклическая организация была предвидена Тунбергом (1920), как показано слева, но его предположение о том, что решающая реакция дает янтарную кислоту из уксусной кислоты, оказалось неверным.

Ганс Кребс пришел к этому проекту с целью найти циклическое решение, в первую очередь благодаря его собственному успеху в разработке орнитинового цикла с Ганселейтом в 1932 году. Хотя такие циклы были рождены химической необходимостью, он интересовался их функциональным значением. и организация. Кребс [1946-8] предположил, что они фактически состояли из двух уровней циклов.Внешний метаболический цикл многократно регенерирует исходный субстрат посредством серии промежуточных реакций, как показано на рисунке 2 для цикла Кребса и его исходного субстрата, цитрата. Однако каждая из этих реакций зависит от ферментного цикла, который проще, поскольку в нем участвуют разные формы одного и того же фермента, а не ряд промежуточных продуктов. Он отметил (стр. 92), что метаболические циклы — это «сложные механизмы, которые могут быть разделены на цепочку ферментных циклов», тогда как ферментные циклы «не могут быть далее разделены на более мелкие циклы.На рисунке 3 показано, как Кребс представлял это как цикл циклов. Если взять в качестве примера ферментный цикл в верхнем левом углу, соответствующий субстрат (малат) сначала связывается с ферментом (яблочная дегидрогеназа), образуя «ферментно-субстратный комплекс» — первый шаг в реакции окисления, достигаемой этим циклом. Фермент берет два атома водорода из малата и отправляет продукт (оксалоацетат) в следующий ферментный цикл (справа), который сам временно принимает форму дигидромалиновой дегидрогеназы. Затем лишние атомы водорода объединяются с доступным кислородом с образованием воды, оставляя яблочную дегидрогеназу свободной, чтобы начать следующий виток этого цикла, снова принимая молекулу малата (отправленную из предыдущего ферментного цикла как продукт реакции с фумаратом).Внешняя петля метаболитов (в которой малат является промежуточным звеном между фумаратом и оксалоацетатом, например) находится «на другом уровне химической организации живого вещества» (стр. 92), чем петли ферментов, которые ее создают. Кребс утверждал, что такие сложно организованные метаболические циклы характерны для жизни — в отличие от ферментных циклов, которые организованы так же, как неодушевленные каталитические циклы — и его заинтриговало то, как они позволяют организмам поддерживать себя.

Рисунок 3.Кребс [1946-48] характеризует цикл Кребса как цикл циклов. (Обратите внимание, что цитрат был опущен, потому что его статус в качестве исходного субстрата был временно под сомнением.)

В конце концов, Кребс намекнул на более глубокие причины циклической организации, чем восстановление исходного состояния. ⁶ Тем не менее, аналогичная идея была продвинута гораздо глубже венгерским химиком Тибором Ганти [1975], который стремился охарактеризовать простейшую химическую систему, которая могла бы проявлять основные черты жизни.Как и Матурана и Варела [1980], Ганти подчеркивал необходимость в такой системе, чтобы поддерживать себя и идентифицировал циклическую организацию как позволяющую системе после того, как она выполняет процесс, быть в состоянии, необходимом для выполнения процесса снова. Это верно не только для биологических систем, но и для двигателей и других машин, созданных человеком. Тем не менее, мыслительные циклы Ганти были особенно важны для живых организмов, потому что они должны регулярно набирать материю и энергию из окружающей среды и использовать их для построения себя (при этом изгоняя то, что они не используют, как отходы).Таким образом, он принял абстрактную характеристику цикла Кребса как сердцевину своей метаболической системы и объединил ее с ограничивающей мембраной (созданной самой этой системой), которая регулирует накопление метаболитов. Вместе они составляли «суперсистему», которая могла проявлять фундаментальные биологические свойства самоподдержания, роста и воспроизводства.

Кребс ожидал большей роли циклов по мере того, как биохимики продвигали свои исследования: «Даже если конкретное значение циклов все еще остается загадкой, тот факт, что многие процессы оказались циклами, предполагает в качестве рабочей гипотезы, что другие механизмы как еще неизвестные могут быть циклами »(стр.98). Он был прав в том, что количество известных циклов увеличится, но, возможно, его разочаровало ограниченное стремление к объяснению. Внимание к циклической организации не приветствуется даже условными обозначениями; последовательные последовательности реакций (как показано для гликолиза на рисунке 1) удобны, но также отражают и укрепляют существенно линейную концептуальную основу. Рисунок 4 передает ограничения линейной структуры путем сравнения сокращенной версии рисунка 1 (слева) с версией с красной диаграммой, которая показывает значительную циклическую организацию (справа).Простейший цикл получается путем соединения боковой петли, в которой NAD ⁺ восстанавливается при окислении глицеральдегид-3-фосфата с циклом, в котором НАДН окисляется при восстановлении пирувата до спирта. Это показывает, как водород, захваченный в реакции восстановления, таким образом становится доступным ниже по потоку для потребления в реакции окисления (с НАД в качестве носителя).

Рис. 4. Здесь повторяется линейная схематизация на рис. 1 (показаны только те реакции, в которых участвуют НАД или АТФ), чтобы контрастировать с повторным представлением гликолитического процесса, в котором замкнуты петли с участием НАД и АТФ.

Цикл АДФ / АТФ немного сложнее понять, отчасти потому, что потребление энергии, хранящейся в третьей фосфатной связи АТФ (PO ₄ , также обозначается P _i ), происходит раньше при гликолизе, чем реакции, которые захватывают и хранить энергию в таких связях. (Здесь нет никакого трюка; реакции АТФ → АДФ используют поступление АТФ в среду из более ранних циклов гликолиза или из других систем реакций.) Кроме того, диаграмма приспособлена для того, чтобы учесть тот факт, что четыре различных реакции фосфорилирования являются задействованы (два потребления и два хранилища).Но в конечном итоге АТФ производится вдвое больше, чем потребляется. Ключом к пониманию этого является разделение единой молекулы на две молекулы. Реакции фосфорилирования, которые потребляют энергию от АТФ, предшествуют расщеплению, а реакции дефосфорилирования, которые накапливают энергию в АТФ, следуют за ними, таким образом вовлекая в два раза больше молекул. Это делает две молекулы АТФ доступными для повторного входа в гликолитический путь (путем фосфорилирования сначала молекулы глюкозы, а затем продукта этой реакции, фруктозо-6-фосфата) и оставляет две дополнительные молекулы АТФ доступными для другой работы (например.г., синтез белка).

Короче говоря, отказ от последовательной системы обозначений помогает нам понять решающую роль циклически организованных процессов. Рисунок 4 показывает, как циклы с участием НАД и АТФ объединяют катаболические реакции гликолиза в связную систему, и намекает на динамизм этой системы. Более того, хотя эти циклы не показаны здесь конкретно, они связывают гликолиз с другими биохимическими системами. Например, АТФ используется для синтеза белка и множества других энергоемких задач, а НАДН перемещается в матрицу митохондрий, где он связывается с окислительным метаболизмом — особенно с цепью переноса электронов, которая использует водород (электроны), переносимый НАДН из гликолиза. и цикл Кребса для усиления окислительного фосфорилирования (особенно эффективного преобразования АДФ в АТФ).Это придает нашей биохимии характер маленьких миров Уоттса и Строгреца [1998] : сети, в которых большинство связей находится между локальными компонентами, но несколько более удаленных связей служат для интеграции всей сети. Общую метаболическую систему можно рассматривать как сеть небольшого мира. Каждый путь имеет ряд локальных звеньев, например, последовательную основу реакций гликолиза, но пути связаны друг с другом более удаленными звеньями, особенно теми, которые связаны с циклом НАД.Мы вернемся к рассмотрению роли, которую это может играть в координации и регулировании операций внутри клетки, после того, как сначала рассмотрим колебательные явления.

Влияние производных янтарной кислоты и хитозана на активность аконитатгидратазы и содержание цитрата в тканях мозга крыс в условиях ишемии / реперфузии

1.

Болдырев А.А., Сорос. Образов. Ж. , 7 (4), 21 — 28 (2001).

Google ученый

2.

П. Р. Гарднер, Д. Д. Нгуен и К. В. Уайт, Proc. Natl. Акад. Sci. США , 91 (25), 12248 — 12252 (1994).

Артикул PubMed Central CAS PubMed Google ученый

3.

К. Мураками и М. Йошино, Biochem. Мол. Биол. Int. , 41 (3), 481 — 486 (1997).

CAS PubMed Google ученый

4.

Коваленко А.В., Белякова Н.В., Фармация , № 5-6, 40-43 (2000).

5.

Кондрашова М.Н., Вопр. Биол. Med. Ферма. Хим. , № 1, 7 — 12 (2002).

6. ​​

М. Н. Кондрашова (ред.), Лечебное действие янтарной кислоты , Институт Биофизики Акад. Пущино, АН СССР, 1976, с. 122 — 234.

Google ученый

7.

Ю. Ю.Ивницкий, А.И. Головко, Г.А. Софронов, Янтарная кислота как средство метаболической коррекции функционального состояния и резистентности in vivo , Лань, Санкт-Петербург (1998), с. 10 — 80.

Google ученый

8.

С.А. Румянцева, Вестн. Интенсив. Тер. , № 3, 23 — 26 (2005).

9.

A. Steinbeuchel и R.H. Marchessault (ред.), Биополимеры для медицинских и фармацевтических применений. Том. 1: Гуминовые вещества, полиизопреноиды и полисахариды , Wiley-VCH, Weinheim (2005), стр. 542-568.

Google ученый

10.

К. Ноэрати, К. Л. Радиман, С. Ахмад и др., В: Proceedings of the International Seminar on Chemistry , pp. 703-708 (2008).

11.

G. Q. Ying, H. Yang, Y. Yi, et al., Afr. J. Biotechnol. , 8 (17), 4260 — 4264 (2009).

CAS Google ученый

12.

Булон В.В., Хниченко Л.С., Сапронов Н.С. и др., Бюл. Эксп. Биол. Med. , 129 (2), 149 — 151 (2000).

Артикул Google ученый

13.

Афанасьев В.Г., Зайцев В.С., Вольфсон Т.И., Lab. Дело , № 4, 115 — 116 (1973).

14.

Э. Ллоид, У. Ледерман, Ю.Н. Тюрин (ред.), Справочник по прикладной статистике , Vol. 1, Финансы и статистика, , Москва (1989), с. 141 — 197.

15.

Сафонова О.А., Попова Т.Н., Сливкин А.И. и др., Эксп. Клин. Фармакол. , 77 (1), 7 — 9 (2014).

CAS PubMed Google ученый

16.

Сафонова О.А., Сливкин А.И., Попова Т.Н. и др., Вопр. Биол. Med.Ферма. Хим. , № 9, 44 — 49 (2011).

17.

Сафонова О.А., Попова Т.Н., Панченко Л.Ф., Вопр. Биол. Med. Ферма. Хим. , № 8, с. 30 — 34 (2010).

Янтарная кислота — как она образуется, как она влияет на титруемую кислотность и какие факторы влияют на ее концентрацию в вине?

Винификация — это сложный процесс, включающий взаимодействие между микробами и виноградным суслом, в результате которого получается вино. Ключевыми микроорганизмами являются ферментативные дрожжи, которые превращают кислое, сладкое виноградное сусло со слабым вкусом в характерный алкогольный напиток с сильным вкусом.По сути, этот процесс представляет собой спиртовую ферментацию, включающую биохимическое превращение гексозных сахаров в этанол и диоксид углерода. Центральный гликолитический путь, связанный с восстановительным образованием этанола, обеспечивает энергию, молекулы-предшественники и снижает мощность для роста, поддержания и размножения клеток. Кроме того, гликолитические и связанные с ними пути образуют летучие и нелетучие метаболиты, которые вносят вклад в аромат вина. Виды дрожжей, условия ферментации и содержание питательных веществ в сусле регулируют производство этих соединений и, следовательно, профиль вкуса вина (Lambrechts and Pretorius 2000; Fleet 2003; Romano et al.2003b; Swiegers et al. 2000). В течение последних десятилетий исследования роли дрожжей в формировании аромата вина выявили сложные взаимодействия между этим микробом и соединениями винограда; многие из этих взаимодействий влияют на внешний вид, аромат, вкус и текстуру вина. Когда древесина используется в ферментации, некоторые древесные ароматизаторы также могут быть модифицированы дрожжами. Вместе все эти соединения, которые присутствуют в сусле, производятся и модифицируются во время ферментации и других процессов, способствуют отличительному «сортовому» характеру вина.Хотя многие вина по-прежнему производятся с минимальным вмешательством и полагаются на местные дрожжи, присутствующие в сусле, современное виноделие основано на использовании отобранных штаммов Saccharomyces cerevisiae, которые обладают надежными ферментационными свойствами в сочетании с хорошими вкусовыми характеристиками. По мере того, как наше понимание влияния дрожжей на вкус вина улучшилось, были выбраны штаммы, которые менее подвержены образованию неприятного запаха и лучше усиливают различные компоненты аромата вина.Химическая идентификация ключевых вкусовых соединений и определение генетической и биохимической основы ассоциированных метаболических путей и их регуляции часто отстают от использования выбранных штаммов, но остаются важным шагом в развитии дрожжей с улучшенными вкусовыми качествами, которые лучше адаптирован к виноградному суслу (Henschke 1997; Pretorius 2000; Swiegers et al. 2005). Характеристика видов Saccharomyces еще больше расширила способность виноделов регулировать вкус вина из-за большей генетической и метаболической изменчивости.В связи с поиском еще большего разнообразия винных вкусов, не-Saccharomyces, происходящие из винограда, также оцениваются и разрабатываются новые стратегии инокуляции, чтобы использовать их свойства комплексообразования вкуса (Jolly et al. 2006). Дикие дрожжи, хотя и представляют собой неопределенную смесь видов и штаммов, обладают вкусовыми характеристиками, которые не могут быть легко достигнуты другими методами. В этой главе будут обобщены микробиологические, физиологические и биохимические взаимодействия между соединениями винограда и метаболизмом дрожжей, которые приводят к развитию аромата вина.Будет подчеркнута роль различных дрожжей и стратегий инокуляции в модуляции вкуса вина, и будет кратко обсужден потенциал улучшения вкуса вина с помощью передовых методов скрининга и генетических методов. Термин «аромат» будет использоваться в самом широком смысле для обозначения аромата, вкуса и ощущения во рту. Таксономия дрожжей соответствует Kurtzman and Fell (1998), за исключением бывшего вида Saccharomyces uvarum, статус которого до сих пор не определен (Nguyen and Gaillardin 2005), и поэтому он будет зарегистрирован как Saccharomyces разновидностей bayanus / uvarum Дрожжевой ген и Обозначения ферментов соответствуют базе данных генома Saccharomyces (http: // yeastgenome.org).

Сукцинат является предпочтительным сигналом связывания метаболических стимулов для трансляции биосинтеза проинсулина, индуцированного глюкозой

Abstract

Вторичные сигналы, исходящие от повышенного метаболизма глюкозы, которые приводят к специфическому увеличению трансляции биосинтеза проинсулина, остаются неуловимыми. Известно, что сигналы для стимулированной глюкозой секреции инсулина и биосинтеза проинсулина расходятся по ходу гликолиза. Следовательно, митохондриальные продукты АТФ, промежуточные соединения цикла Кребса, глутамат и ацетоацетат были исследованы в качестве возможных сигналов связывания стимула, специфичных для индуцированного глюкозой биосинтеза проинсулина в островках крысы.Снижение уровней АТФ ингибиторами окислительного фосфорилирования показало сопоставимые эффекты на биосинтез проинсулина и общий синтез белка. Хотя это кофактор, маловероятно, что АТФ является сигналом связывания метаболических стимулов, специфичным для индуцированного глюкозой биосинтеза проинсулина. Ни метиловый эфир глутаминовой кислоты, ни метиловый эфир ацетоуксусной кислоты не проявили специфического действия на стимулированный глюкозой биосинтез проинсулина. Интересно, что среди промежуточных продуктов цикла Кребса только монометиловый эфир янтарной кислоты специфически стимулировал биосинтез проинсулина.Метиловый эфир малоновой кислоты, ингибитор сукцинатдегидрогеназы, также специфически увеличивал индуцированный глюкозой биосинтез проинсулина, не влияя на уровни островкового АТФ или секрецию инсулина. Глюкоза вызвала увеличение на 40% уровней внутриклеточного сукцината островков, но метиловый эфир малоновой кислоты не показал дальнейшего эффекта, вероятно, из-за эффективного преобразования сукцината в сукцинил-КоА. В связи с этим в цитозольных фракциях островков поджелудочной железы была обнаружена ГТФ-зависимая активность сукцинил-КоА синтетазы.Таким образом, сукцинат и / или сукцинил-КоА, по-видимому, являются предпочтительными факторами связывания метаболических стимулов для индуцированной глюкозой трансляции биосинтеза проинсулина.

Нормальный гомеостаз глюкозы зависит от регулируемого производства и секреции инсулина β-клетками поджелудочной железы. Как правило, когда высвобождение инсулина увеличивается за счет стимулятора секреции питательных веществ, происходит сопутствующая активация биосинтеза проинсулина на трансляционном уровне для быстрого пополнения запасов инсулина β-клеток. Однако сообщалось о некоторых различиях в сигнальных путях связывания стимулов для этих двух процессов β-клеток (1).Например, сульфонилмочевины (2) и жирные кислоты (3,4) стимулируют секрецию инсулина, но не влияют на повышающую регуляцию биосинтеза проинсулина. Тем не менее, одной общей характеристикой секреции инсулина и биосинтеза проинсулина является потребность в метаболизме глюкозы. Глюкоза метаболизируется в β-клетках поджелудочной железы посредством гликолиза в цитозоле, что приводит к выработке пирувата. Затем пируват транспортируется в митохондрии для метаболизма цикла Кребса, поддерживая последующее окислительное фосфорилирование и производство АТФ (5-7).Генерация АТФ за счет увеличения метаболизма глюкозы способствует увеличению цитозольного соотношения АТФ / АДФ, закрытию АТФ-зависимого канала K ⁺ , открытию потенциалочувствительного канала Ca ²⁺ и последующему увеличению цитозольного концентрация свободного кальция, вызывающая высвобождение инсулина (8). Напротив, биосинтез проинсулина, стимулируемый глюкозой, не зависит от внеклеточного кальция (1). Анаплероз является важным условием для индуцированной глюкозой секреции инсулина (9–12) и необходим для индуцированного глюкозой биосинтеза проинсулина (3).Анаплероз может ускорять активность цикла Кребса в β-клетках (9) и, таким образом, производство АТФ; однако другие продукты покидают цикл в ответ на анаплероз и могут действовать как факторы, связывающие метаболические стимулы для функций β-клеток (8,9). Например, цитрат был предложен в качестве вторичного метаболического фактора связывания для стимуляции высвобождения инсулина (13,14). Отток цитрата из митохондрий вызывает увеличение цитозольного малонил-КоА, который ингибирует окисление жирных кислот и приводит к повышению цитозольного длинноцепочечного жирного ацил-КоА, который, как предполагалось, является фактором сопряжения секреции инсулина (13, 15).Однако свободные жирные кислоты, которые стимулируют секрецию инсулина, не влияют на базальный биосинтез проинсулина и умеренно ингибируют стимулируемый глюкозой биосинтез проинсулина (3,4). Следовательно, маловероятно, что малонил-КоА и / или длинноцепочечный жирный ацил-КоА являются сигналами механизма сцепления со стимулом, специфичного для индуцированного глюкозой биосинтеза проинсулина. Также было высказано предположение, что глутамат, который образуется в митохондриях из α-кетоглутарата и затем экспортируется в цитозоль, является сигналом метаболического связывания для регуляции глюкозо-стимулированного экзоцитоза инсулина (16).Однако глутамат лишь незначительно увеличивал стимулированную глюкозой секрецию инсулина при промежуточных концентрациях глюкозы (16,17), и его возможная роль в качестве вторичного связующего сигнала стимула для индуцированного глюкозой высвобождения инсулина остается спорной (18). Независимо от того, действует ли глутамат или цитрат в качестве фактора метаболического связывания для стимулированного глюкозой биосинтеза проинсулина, не исследовалось.

Глюкозная регуляция биосинтеза проинсулина (1) и секреция инсулина (14) требуют метаболизма β-клеток и анаплероза.Однако следует понимать, что соответствующие дистальные мишени либо аппарата трансляции синтеза белка, либо аппарата экзоцитоза в β-клетках весьма различны. Таким образом, метаболические пути связывания стимулов для индуцированного глюкозой биосинтеза проинсулина и секреции инсулина, возможно, разветвляются друг от друга в точке за пределами анаплероза. В то время как сигнальный путь для индуцированной глюкозой секреции инсулина был частично относительно хорошо описан (8,9), сигнальный путь для трансляционного контроля биосинтеза проинсулина изучен плохо.В этом исследовании мы исследовали, могут ли сигналы сопряжения со стимулом, возникающие в митохондриях, участвовать в регуляции биосинтеза проинсулина, индуцированного глюкозой. Среди исследованных были промежуточные соединения цикла Кребса, глутамат, ацетоацетат и АТФ. Мы сравнили их влияние на биосинтез проинсулина с общим синтезом белка и секрецией инсулина в одних и тех же изолированных островках поджелудочной железы, чтобы лучше идентифицировать потенциальные регуляторные различия между метаболическими путями связывания стимулов для этих функций β-клеток.

ДИЗАЙН И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Материалы.

EasyTag Expre ³⁵ S ³⁵ S Смесь для маркировки белков (NEN, Бостон, Массачусетс), содержащая 73% 1- [ ³⁵ S] метионина, была использована для метаболической радиоактивной метки островков. (Мы будем называть его метионином [ ³⁵ S].) Сыворотка морских свинок против бычьего инсулина была получена от Sigma. Промежуточные продукты митохондриального цикла Кребса, ингибиторы окислительного фосфорилирования и другие реагенты были от Sigma или Aldrich.

Выделение островков и субклеточное фракционирование.

Островки Лангерганса выделяли из поджелудочной железы самцов крыс Sprague-Dawley весом ~ 250 г, как описано ранее (19,20).

Для субклеточного фракционирования партии из ~ 1000 островков гомогенизировали в 0,25 моль / л сахарозы, 10 ммоль / л MgCl ₂ , 1 ммоль / л EDTA и 50 ммоль / л буфера HEPES, pH 7,4, содержащего ингибиторы протеаз [ 0,01 ммоль / л каждого из фенилметилсульфонилфторида, пепстатина-A, N — p -тозил- _l -лизинхлорметилкетона и транс -эпоксисукцинил- _l -лейцил-амино- (4-гуанидино) ) бутан, а также 0.1 ммоль / л лейпептина] за 10 движений в измельчителе тканей Potter-Elvehjen. Гомогенаты центрифугировали при 1000, г, в течение 5 минут для удаления ядер и остатков цельных клеток. Постядерный супернатант центрифугировали при 10 000 g в течение 30 минут, и этот супернатант дополнительно центрифугировали при 100 000 g в течение 60 минут. Полученный супернатант (S100; обогащенная цитозолем фракция) концентрировали до 0,1 мл в концентраторе microcon-10 (Amicon-Millipore, Bedford, MA). Осадок 10000 г (P10), который содержит, среди других органелл, митохондрии, был восстановлен обработкой ультразвуком в 0.1 мл 50 ммоль / л HEPES, pH 8,0, содержащего 1% Triton X-100 и ингибиторы протеаз. Все процедуры проводились при 4 ° C. Обогащение цитозольной фракции определяли с помощью маркерного ферментного анализа лактатдегидрогеназы (ЛДГ). Превращение НАД (1 мг / мл) в НАДН в присутствии 1 ммоль / л лактата в 0,1 моль / л фосфатного буфера, pH 7,4, с помощью 10 мкл (5–10 мкг белка) цитозоля или фракции P10 контролировали при 340 нм. Загрязнение митохондрий в цитозольной фракции определяли путем анализа присутствия ферментативной активности маркера глутаматдегидрогеназы (GDH).Превращение НАД (0,5 мг / мл) в НАДН 10 мкл (5–10 мкг белка) цитозоля или фракции P10 в присутствии глутамата в 0,1 моль / л Трис, 0,4 моль / л гидразингидрата, 10 ммоль / л MgCl ₂ , 5 ммоль / л EDTA, pH 8,5, буфер контролировали при 340 нм. Активность ЛДГ составляла 8,0 ± 1,6 нмоль НАДН · мин ^-1 · мг ^-1 белка в цитозольной фракции S100 по сравнению с 0,11 ± 0,11 во фракции, обогащенной митохондриями P10 ( n ≥ 2). Это представляет более чем 80-кратное обогащение цитозоля фракцией S100 по сравнению с фракцией, обогащенной митохондриями P10.Напротив, активность GDH составляла 0,32 ± 0,07 нмоль НАДН · мин ^-1 · мг ^-1 белка в цитозоле по сравнению с 6,5 ± 3,7 во фракции P10 ( n ≥ 2). Это представляло более чем 20-кратное увеличение активности митохондриального маркерного фермента во фракции P10 по сравнению с цитозольной фракцией S100. Более того, активность GDH в цитозоле составляла только ≤5% от активности во фракции P10, что указывает на очень низкую контаминацию митохондрий в цитозольной фракции S100. Количество инсулина, измеренное с помощью радиоиммуноанализа в цитозольной фракции S100, составляло 1.4 ± 0,1 мкг / мг белка против 128,4 ± 1,4 во фракции P10 ( n ≥ 2). Это представляло ≤2% контаминации секреторных гранул инсулина во фракции цитозоля S100, что сопоставимо с ≤5% низкой степенью загрязнения митохондрий.

Биосинтез проинсулина и секреция инсулина в изолированных островках крысы.

Биосинтез проинсулина исследовали в экстрактах [ ³⁵ S] метионина, метаболически меченных радиоактивными изотопами изолированных островков, и секрецию инсулина анализировали в инкубационной среде тех же островков.Мечение островков радиоактивной меткой было в основном таким, как описано ранее (20). Вкратце, партии из 40 островков предварительно инкубировали при базовых условиях (0 или 2,8 ммоль / л глюкозы) в течение 1 часа при 37 ° C в 0,2 мл модифицированного бикарбонатного буфера Кребса-Рингера, 20 ммоль / л HEPES и 0,1% BSA (KRBH). . Затем инкубационную среду заменяли 0,2 мл свежего буфера KRBH, содержащего указанный реагент. После 1-часового периода инкубации при 37 ° C 0,1 мл среды собирали и хранили при -20 ° C до радиоиммуноанализа на секрецию инсулина.Сразу же добавляли 0,1 мКи [ ³⁵ S] метионина и инкубацию продолжали в течение 30 минут. Радиоактивно меченые островки лизировали, (про) инсулин иммунопреципитировали из лизата, и иммунопреципитат подвергали щелочно-мочевинному PAGE и флюорографии, как описано ранее (19, 20). Общий синтез белка определяли путем осаждения трихлоруксусной кислотой (ТХК) в аликвоте лизата объемом 5 мкл (20). Еще одну аликвоту 5 мкл отделили и хранили при -20 ° C до радиоиммуноанализа на содержание внутриклеточного инсулина.Радиоиммуноанализ инсулина проводили с использованием стандартов инсулина крыс и антител от Linco (Linco Research, Сент-Чарльз, Миссури) и человеческого инсулина ¹²⁵ I от Eli Lilly (Индианаполис, Индиана). Секрецию инсулина рассчитывали как процент содержания островкового инсулина.

Измерение содержания АТФ в изолированных островках крысы.

Общее содержание АТФ в островковых клетках определяли как активность люциферазы в островках, экспрессирующих кДНК люциферазы светлячка ( Photinus pyralis ) (21). Партии из ~ 250 островков были инфицированы аденовирусом люциферазы светлячков, как описано ранее (22).Затем островки распределяли в пробирки на 1,5 мл (20 островков на пробирку), промывали 0,5 мл KRBH, предварительно инкубировали в 0,1 мл KRBH в базовых условиях и инкубировали в 0,1 мл свежей среды, содержащей указанный агент. Затем островки лизировали и определяли активность АТФ-зависимой люциферазы в клеточных экстрактах с использованием системы анализа люциферазы Promega (Promega, Madison, WI). Излучение света регистрировали люминометром (TD-20/20; Promega). В линейном диапазоне (0,5–5 ммоль / л АТФ) увеличение концентрации АТФ на 1 ммоль / л эквивалентно 10 000 относительных единиц люминесценции в анализе in vitro.Это согласуется с предыдущими исследованиями, в которых активность люциферазы использовалась в качестве относительного анализа концентрации АТФ (23). Люминесценция не обнаруживалась в лизатах неинфицированных или контрольных островков, инфицированных β-галактозидазой.

Анализ сукцината, малата и фумарата.

Общее содержание сукцината, малата и фумарата в островках измеряли в изолированных островках, инкубированных в присутствии 2,8 ммоль / л глюкозы, 16,7 ммоль / л глюкозы или 16,7 ммоль / л глюкозы плюс 1 ммоль / л метилового эфира малоновой кислоты.Партии из 200-500 островков предварительно инкубировали при 37 ° C в течение 1 часа в KRBH (0,1 мл / 100 островков) в присутствии базальной 2,8 ммоль / л глюкозы, а затем инкубировали в течение дополнительного часа в соответствующем объеме KRBH (0,1 мл / 100 островков), содержащий указанный агент. После инкубации островки обрабатывали ультразвуком в течение 30 с в 10% TCA и инкубировали на льду в течение 15–30 мин. Растворимый материал TCA пять раз промывали эфиром для удаления TCA и повышения pH, а затем лиофилизировали и хранили при -80 ° C до анализа.Пул от двух до четырех экспериментов (всего около 1000 островков) использовали в качестве одного эксперимента для каждого анализа. Содержание островков сукцината, малата и фумарата анализировали в растворимой фракции TCA, следуя флуорометрическим ферментативным методам, описанным Williamson и Corkey (24). По сути, сукцинат измеряли с использованием метода циклического фермента / амплификации с сукцинаттиокиназой (ITP-зависимой; Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Германия), пируваткиназой и ЛДГ, используя для считывания снижение флуоресценции НАДН.Чувствительность этого анализа позволила измерить <1 нмоль сукцината (24). Уровни малата определяли с использованием активности малатдегидрогеназы, а уровни фумарата определяли с использованием активности фумаразы и малатдегидрогеназы, причем оба анализа использовали увеличение флуоресценции NADH в качестве считываемого значения. Чувствительность тестов на малат и фумарат позволила измерить ~ 1 нмоль малата / фумарата (24). Значения были нормализованы по концентрации ДНК. Для анализа ДНК материал, осажденный TCA, растворяли в 0.1 н. NaOH, и содержание ДНК определяли с использованием красителя Hoechst 33258 (1 мкг / мл PBS), как ранее описано Labarca и Paigen (25).

Анализ активности сукцинил-КоА синтетазы.

Активность сукцинил-КоА синтетазы (SCS) измеряли во фракции островкового цитозоля в направлении реакции сукцинил-КоА на сукцинат. Высвобождение CoA-SH из сукцинил-CoA контролировали спектрофотометрически при 415 нм по его реакции с DTNB (реагент Эллмана) в течение 15 минут с использованием считывающего устройства для микропланшетов (Packard, Meriden, CT).Реакции начинали добавлением 0,2 мл буфера для анализа (10 ммоль / л Трис, pH 7,1, 10 ммоль / л MgCl ₂ , 0,2 ммоль / л DTNB и 1 ммоль / л сукцинил-КоА) ± 0,1 ммоль / л GTP или АТФ в 10 мкл (5–10 мкг белка) цитозольной фракции островков. Параллельно, в качестве контроля специфического гидролиза сукцинил-КоА, ту же реакцию проводили в присутствии ацетил-КоА или ацетоацетил-КоА. Контрольные значения в отсутствие фракции островков вычитали для корректировки неспецифического гидролиза производных КоА, а конечные значения нормализовали по общим концентрациям белка.

Анализ сукцинил-КоА с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Активность

SCS в островковом цитозоле также исследовали с помощью анализа образования сукцинил-КоА из сукцината и КоА in vitro методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Реакции проводили в течение 5 мин при 30 ° C в 0,1 мл 50 ммоль / л сукцината, 110 ммоль / л Триса, pH 7,4, 10 ммоль / л MgCl ₂ и 0,1 ммоль / л CoA ± 0,1 ммоль / л. ГТФ или АТФ, содержащие ~ 8 мкг белка островковой цитозольной фракции. В параллельных анализах исследовали образование ацетоацетил-КоА и ацетил-КоА из ацетоацетата и ацетата.Сразу после завершения периода реакции образцы подвергали ВЭЖХ, как описано ранее (26), но со слегка измененным градиентом элюирования, как описано в легенде на фиг. 6.

Статистический анализ.

Статистически значимые различия между группами были проанализированы с использованием теста Стьюдента t для непарных выборок.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Влияние промежуточных продуктов цикла Кребса на биосинтез островкового проинсулина, секрецию инсулина и содержание АТФ.

Было исследовано, могут ли промежуточные продукты цикла Кребса действовать как специфические сигналы сопряжения со стимулом для стимулированного глюкозой биосинтеза проинсулина. Сложные эфиры цитрата, сукцината, фумарата, малата и оксалоацетата карбоновых кислот использовали для облегчения их клеточного поглощения. Затем сложные эфиры карбоновых кислот внутриклеточно переводили в кислотную форму (27). Стимуляция биосинтеза проинсулина 16,7 ммоль / л глюкозы была в 5,7 ± 0,9 раза больше, чем 2,8 ммоль / л глюкозы ( P <0.01, n = 13). Монометиловый эфир янтарной кислоты (20 ммоль / л) значительно стимулировал биосинтез проинсулина в 2,6 ± 0,4 раза ( P <0,01, n = 12) (рис. 1 A ) независимо от глюкозы. Однако ни один из других промежуточных продуктов цикла Кребса (также в концентрации 20 ммоль / л) не оказывал заметного влияния на стимуляцию биосинтеза проинсулина. Только 16,7 ммоль / л глюкозы значительно стимулировали синтез общего белка островков (1,6 ± 0,1 раза; P <0.01, n = 13) (рис.1 B ). Секреция инсулина значительно стимулировалась (16,8 ± 2,5 раза; P <0,01, n = 17) глюкозой 16,7 ммоль / л, а также триэтиловым эфиром лимонной кислоты (3,0 ± 0,6 раза; P <0,01 , n = 9) и монометиловым эфиром янтарной кислоты (5,2 ± 1,0 раза; P <0,01, n = 11) (рис.1 C ). Стимуляция биосинтеза проинсулина и секреции инсулина, вызванная сукцинатом, составила 46 и 31% соответственно от глюкозо-индуцированного ответа.Уровни внутриклеточного АТФ исследовали на островках, экспрессирующих кДНК люциферазы светлячка, путем измерения АТФ-зависимой активности люциферазы. Только стимулирующая (16,7 ммоль / л) глюкоза значительно увеличивала уровень островкового АТФ (рис. 1 D ). Это увеличение было на 40% выше уровня АТФ, наблюдаемого при 2,8 ммоль / л глюкозы ( P <0,01, n = 6). Напротив, содержание АТФ в островках, инкубированных в присутствии триэтилового эфира лимонной кислоты или диэтилового эфира щавелевоуксусной кислоты, было на 36 и 26% соответственно ниже, чем наблюдаемое при 2.8 ммоль / л глюкозы.

Биосинтез проинсулина, стимулируемый метиловым эфиром янтарной кислоты, не зависит от повышенной секреции инсулина.

Чтобы продемонстрировать, что стимуляция биосинтеза проинсулина метиловым эфиром янтарной кислоты, а также глюкозой не является следствием повышенного высвобождения инсулина, изолированные островки инкубировали в условиях, при которых секреция инсулина подавлялась, например, при отсутствии внеклеточного кальция или наличие соматостатина. Ни удаление внеклеточного кальция из среды инкубации островков, ни добавление 1 мкмоль / л соматостатина не влияли на уровни мРНК препроинсулина (рис.2 A ) или стимулированный глюкозой и стимулированный метиловым эфиром янтарной кислоты биосинтез проинсулина (рис. 2 B ). Напротив, как и ожидалось, в тех же островках как отсутствие внеклеточного кальция, так и присутствие соматостатина значительно ингибировали стимулированную глюкозой секрецию инсулина, в 5,8 ± 1,0 раза и 3,0 ± 0,2 раза, соответственно (рис. 2 C ). ). Более того, секреция инсулина, стимулированная метиловым эфиром янтарной кислоты, также была значительно снижена, в 2,4 ± 0,6 раза из-за истощения запасов кальция и в 2 раза.3 ± 0,3 раза на 1 мкмоль / л соматостатина (рис.2 C ).

Влияние метилового эфира глутаминовой кислоты на стимулируемый глюкозой биосинтез проинсулина, секрецию инсулина и содержание островкового АТФ.

Стимулируемый глюкозой биосинтез проинсулина не изменялся в присутствии 5 ммоль / л метилового эфира глутаминовой кислоты при любой концентрации глюкозы и, во всяком случае, немного снижался на 20 ммоль / л метилового эфира глутаминовой кислоты при концентрациях глюкозы> 2,8 ммоль / l (рис. 3 A ), хотя это не было статистически значимым.На общий синтез белка не влиял метиловый эфир глутаминовой кислоты с концентрацией 5 или 20 ммоль / л. Метиловый эфир глутаминовой кислоты (5 ммоль / л) незначительно увеличивал стимулированную глюкозой секрецию инсулина при промежуточных концентрациях глюкозы, в то время как никакого эффекта в отсутствие глюкозы или на секрецию инсулина, стимулированную глюкозой 16,7 ммоль / л не наблюдалось (рис. 3 B ). ), что согласуется с предыдущими сообщениями (17). Однако, хотя метиловый эфир глутаминовой кислоты 20 ммоль / л не влияет на секрецию инсулина при низких концентрациях глюкозы, он снижает секрецию инсулина, стимулированную глюкозой (рис.3 В ). Этот эффект был статистически значимым ( P <0,02, n = 8) при 16,7 ммоль / л глюкозы. Общее содержание АТФ в островках было значительно ( P <0,05) увеличено за счет глюкозы при концентрациях> 5,5 ммоль / л по сравнению с базальной глюкозой (2,8 ммоль / л). Метиловый эфир глутаминовой кислоты ингибировал индуцированное глюкозой увеличение содержания островкового АТФ при концентрациях глюкозы> 8 ммоль / л, причем этот эффект был более сильным при 20 ммоль / л, чем при 5 ммоль / л метилового эфира глутаминовой кислоты ( P <0.05 для 20 ммоль / л) (рис.3 C ).

Стимулируемый глюкозой биосинтез проинсулина и секреция инсулина по-разному ингибируются ингибиторами окислительного фосфорилирования митохондрий.

Чтобы исследовать, является ли АТФ сигналом связывания со стимулом, специфичным для стимулированного глюкозой биосинтеза проинсулина, окислительное фосфорилирование митохондрий было ингибировано на нескольких этапах в цепи переноса электронов. В качестве ингибиторов использовались ротенон для комплекса I (НАДН-дегидрогеназа), антимицин A1 для комплекса III, динитрофенол (DNP), разобщитель митохондриальной мембраны, который диффундирует протонный градиент через внутреннюю мембрану митохондрий, и олигомицин, ингибитор АТФ-синтазы (комплекс V). .Ротенон, антимицин A1, DNP и олигомицин вызывали дозозависимое снижение общего содержания АТФ в клетках и ингибировали стимулированный глюкозой биосинтез проинсулина, общий синтез белка и секрецию инсулина. На Фигуре 4 представлены кривые ингибирования доза-ответ для олигомицина. Ротенон, антимицин A1 и DNP показали кривые ингибирования, качественно аналогичные этим (не показаны), хотя диапазон ингибирующих концентраций варьировался для каждого ингибитора. Из таких кривых ингибирования титрования рассчитывалась полумаксимальная ингибирующая концентрация (IC ₅₀ ) (таблица 1).Ротенон, антимицин A1 и DNP вызывали параллельное снижение стимулированного глюкозой биосинтеза проинсулина, общего синтеза белка и содержания АТФ со сравнимыми значениями IC ₅₀ , которые существенно не отличались друг от друга (Таблица 1). Однако на тех же островках значения IC ₅₀ для ингибирования стимулированной глюкозой секреции инсулина сильно отличались от значений для ингибирования биосинтеза проинсулина. IC ₅₀ для секреции инсулина в присутствии ротенона был в 3 раза ниже, чем для биосинтеза проинсулина ( P <0.01), в 10 раз ниже с DNP ( P <0,01), в 7 раз выше с антимицином A1 ( P <0,05) и в 4 раза выше с олигомицином ( P <0,05). Для олигомицина значение IC ₅₀ для биосинтеза проинсулина и общего синтеза белка было аналогичным, тогда как значение для островкового АТФ было примерно в четыре раза выше. Это может быть связано с ингибированием олигомицином аппарата синтеза клеточного белка, который не зависит от цепи переноса электронов.Фактически, ранее сообщалось, что олигомицин является ингибитором трансляции синтеза белка (28).

Стимулируемый глюкозой биосинтез проинсулина усиливается метиловым эфиром малоновой кислоты в зависимости от дозы.

Изолированные островки инкубировали при 16,7 ммоль / л глюкозы и возрастающих концентрациях малоната, который использовался в качестве формы-предшественника, и метилового эфира малоновой кислоты для облегчения его клеточного поглощения. Малонат является ингибитором сукцинатдегидрогеназы (29), фермента, который катализирует реакцию сукцинат-фумарат с образованием восстановленного флавинадениндинуклеотида (FADH ₂ ) в цикле Кребса.Ингибирование продукции FADH ₂ может ингибировать цепь переноса электронов митохондрий в комплексе II, где FADH ₂ является донором электронов. Можно было предсказать, что ингибирование сукцинатдегидрогеназы и, следовательно, реакции сукцината на фумарат может привести к увеличению внутриклеточного содержания сукцината. Метиловый эфир малоновой кислоты увеличивал стимулируемый глюкозой биосинтез проинсулина дозозависимым образом (рис. 5 A ). Это увеличение было статистически значимым при 0.5 и 1,0 ммоль / л метилового эфира малоновой кислоты ( P <0,05, n = 6), максимальный эффект достигается при 0,5 ммоль / л со значением на 55% больше, чем при 16,7 ммоль / л глюкозы. При более высоких концентрациях метиловый эфир малоновой кислоты не оказывал влияния на стимулируемый глюкозой биосинтез проинсулина. Метиловый эфир малоновой кислоты не влиял на биосинтез проинсулина при 2,8 ммоль / л глюкозы (данные не показаны). Он также не влиял на базальный (данные не показаны) или стимулированный глюкозой (Фиг. 5 B — D ) общий синтез белка, секрецию инсулина или содержание АТФ при любой из изученных концентраций.

Уровни сукцината повышены в островках крысы, стимулированных глюкозой.

Мы исследовали, увеличивает ли глюкоза содержание промежуточных продуктов цикла Кребса сукцината, фумарата и малата в изолированных островках. Концентрация глюкозы 16,7 ммоль / л значительно увеличивала содержание сукцината в островковых клетках на 40 ± 10% по сравнению с 2,8 ммоль / л глюкозы ( P <0,05, n = 5) и 1 ммоль / л малоновой кислоты. метиловый эфир не оказывал дальнейшего действия (таблица 2). Уровни малата были увеличены на 16.7 ммоль / л глюкозы на 17 ± 4% ( n = 4), но это увеличение не было статистически значимым, и дополнительное присутствие 1 ммоль / л метилового эфира малоновой кислоты не оказало никакого эффекта. Уровни внутриклеточного фумарата не были обнаружены даже в экстракте, полученном из 1000 островков.

Влияние метилового эфира ацетоацетата на стимулируемый глюкозой биосинтез проинсулина, секрецию инсулина и содержание островкового АТФ.

Сукцинил-КоА реагирует с ацетоацетатом с образованием сукцината плюс ацетоацетил-КоА в обратимой реакции.Чтобы определить, может ли эта реакция с участием сукцината и сукцинил-КоА быть частью сигнального механизма связывания со стимулом для индуцированного глюкозой биосинтеза проинсулина, изолированные островки инкубировали при возрастающих концентрациях глюкозы, от базальных 2,8 ммоль / л до стимулирующих 16,7 ммоль / л. в присутствии метилового эфира ацетоуксусной кислоты 10 ммоль / л. Биосинтез проинсулина снижался в присутствии ацетоацетата при всех концентрациях глюкозы (данные не показаны). Однако это снижение происходило в той же степени для общего синтеза белка.Таким образом, маловероятно, что ацетоацетат или ацетоацетил-КоА являются специфическими сигналами связывания для стимулированного глюкозой биосинтеза проинсулина. Кроме того, метиловый эфир ацетоуксусной кислоты с концентрацией 10 ммоль / л не влиял на базальную или стимулированную глюкозой секрецию инсулина и содержание островкового АТФ.

Наличие активности SCS в цитозольной фракции островков крысы.

SCS был недавно идентифицирован в митохондриях клональных β-клеток (30). SCS катализирует GDP (ADP) -зависимую обратимую реакцию сукцинил-CoA на сукцинат, которая, как было описано, происходит в митохондриях клетки (31).Здесь мы обнаружили присутствие ферментативной активности SCS в обогащенной цитозольной фракции из изолированных островков крысы. Скорость образования CoA-SH из сукцинил-CoA (0,31 ± 0,06 A ⁴¹⁵ единиц · мин ^-1 · мг белка ^-1 ) фракцией островкового цитозоля была такой же, как и из ацетоацетил-CoA. (0,31 ± 0,06 A ⁴¹⁵ единиц · мин ⁻¹ · мг белка ⁻¹ ), но в два раза быстрее, чем у ацетил-КоА (0,14 ± 0,02 A ⁴¹⁵ единиц · мин ⁻¹ · мг белка ^-1 ).ВЭЖХ-анализ образования производных КоА из сукцината, ацетата и ацетоацетата фракцией цитозоля островков S100 показал, что только сукцинил-КоА образуется из сукцината в этих условиях анализа (фиг. 6). Анализ ВЭЖХ показал отсутствие пика при соответствующем времени элюирования для ацетоацетил-КоА и ацетил-КоА, независимо от того, использовался ли сукцинат, ацетат или ацетоацетат в качестве субстрата (данные не показаны). Однако пик элюции сукцинил-КоА наблюдался после 5-минутной инкубации сукцината с фракцией островкового цитозоля в присутствии GTP (рис.6 В ). Пик сукцинил-КоА не был обнаружен в отсутствие GTP (фиг. 6 C ) или в присутствии ATP (не показан). Эти данные указывают на наличие GTP-зависимой активности SCS во фракции островкового цитозоля. По данным этого анализа ВЭЖХ, удельная активность SCS во фракции цитозоля островков S100 составила 2,9 ± 0,3 нмоль сукцинил-КоА · мин ^-1 · мг белка ^-1 по сравнению с 10,2 ± 1,7 во фракции, обогащенной митохондриями P10. ( n ≥ 3). Это составляет ~ 25% от общей специфической активности SCS, восстановленной в цитозольной фракции S100, что не соответствует ≤5% митохондриальной контаминации в этой фракции S100, на что указывает активность митохондриального маркера GDH (см. План исследования и методы).Таким образом, это свидетельствует о том, что значительная часть измеренной активности SCS была получена из островкового цитозоля и не могла быть объяснена неспецифическим митохондриальным загрязнением во фракции S100.

ОБСУЖДЕНИЕ

Путь связывания метаболических стимулов для индуцированного глюкозой высвобождения инсулина в β-клетках достаточно хорошо охарактеризован и включает повышенный метаболизм глюкозы, повышение выработки митохондриального АТФ, что, следовательно, увеличивает цитозольное соотношение АТФ / АДФ до близкого АТФ-чувствительный канал K ⁺ (K _ATP -канал), который деполяризует β-клетку, открывая чувствительные к напряжению каналы Ca ²⁺ l-типа, вызывая приток Ca ²⁺ в повышают цитозольный [Ca ²⁺ ] _i , который действует как главный сигнал для запуска экзоцитоза инсулина (8).Однако вторичные метаболические сигналы связывания, необходимые для запуска биосинтеза проинсулина, по существу неизвестны.

Хотя АТФ необходим для синтеза белка, по крайней мере, на уровне аминоацил-тРНК и образования комплекса инициации (32,33), роль АТФ как специфического сигнала для стимулированного глюкозой биосинтеза проинсулина не доказана. В этом исследовании активность люциферазы использовалась в качестве относительного индикатора внутриклеточных уровней АТФ в островках, как описано ранее (21). Это позволило одновременно измерять секрецию инсулина, биосинтез проинсулина, общий синтез белка и колебания уровней АТФ в одних и тех же островках.Однако, хотя это удобный и чувствительный метод, требующий меньшего количества островковых клеток, чем более классические методы (21), признано, что это вторичное измерение АТФ и не отражает изменений в соотношении АТФ / АДФ, которое является более важным. вторичный сигнал для индуцированного глюкозой высвобождения инсулина (8). Тем не менее, аденовирусная экспрессия люциферазы позволила провести сравнительную оценку уровней АТФ в изолированных островках, инкубированных в различных условиях, относительно изменений в биосинтезе проинсулина.Ингибиторы цепи переноса электронов в комплексах I (ротенон) и III (антимицин A1) и разобщитель внутренней мембраны митохондрий, DNP, вызывали параллельное ингибирование уровней АТФ на островках, общего синтеза белка и индуцированного глюкозой биосинтеза проинсулина. Если бы АТФ действовал как фактор сопряжения стимулов для индуцированного глюкозой биосинтеза проинсулина, то можно было бы предсказать, что индуцированный глюкозой биосинтез проинсулина был бы более чувствительным к ингибированию ротеноном, антимицином A1 или DNP (т.е., имеют более низкие значения IC ₅₀ ), чем общий синтез белка или содержание АТФ. Однако это было не так, потому что на индуцированный глюкозой биосинтез проинсулина, общий синтез белка и уровни островкового АТФ аналогичным образом влияли ротенон, антимицин A1 или ДНФ (Таблица 1). Это указывает на то, что АТФ был необходимым кофактором для общего синтеза белка в островках, но не специфическим промежуточным сигналом для трансляции биосинтеза проинсулина, стимулированного глюкозой. Однако, в отличие от этого, что несколько неожиданно, на стимулированное глюкозой высвобождение инсулина по-разному влияли ингибиторы дыхательной цепи и эффекты разобщения ДНФ по сравнению с индуцированным глюкозой ингибированием биосинтеза проинсулина, общим синтезом белка и уровнями АТФ.Эти данные предполагают, что другой сигнал, исходящий от цепи переноса электронов, помимо АТФ, может также опосредовать связывание метаболических стимулов для стимулированной глюкозой секреции инсулина. Такой дополнительный сигнал, генерируемый митохондриями (например, активные формы кислорода [34]), согласуется с существованием так называемого K _ATP -канала и Ca ²⁺ -независимых путей для регуляции стимулируемого питательными веществами секреция инсулина (35,36). Тем не менее, эти данные подчеркивают, что метаболические пути связывания стимулов для индуцированного глюкозой биосинтеза проинсулина и высвобождения инсулина после гликолиза различаются.Поскольку продукт цепи транспорта электронов митохондрий β-клеток / окислительного фосфорилирования, по-видимому, не действует как вторичный сигнал связывания для стимулированного глюкозой биосинтеза проинсулина, такой сигнал, скорее всего, исходит от анаплероза β-клеток (3).

Некоторые эстерифицированные метаболиты цикла Кребса являются мощными стимуляторами секреции инсулина (37,38). Глутамат, образующийся в митохондриях из α-кетоглутарата во время метаболизма глюкозы, также недавно был предложен как фактор сопряжения со стимулами для индуцированного глюкозой высвобождения инсулина (16), хотя в настоящее время это вызывает споры (18).Однако не было обнаружено влияния глутамата на индуцированный глюкозой биосинтез проинсулина. Таким образом, глутамат вряд ли будет действовать как сигнал связывания для индуцированного глюкозой биосинтеза проинсулина. В отличие от секреции инсулина, единственным метаболитом цикла Кребса, который стимулировал биосинтез проинсулина независимо от глюкозы, был монометиловый эфир янтарной кислоты. В соответствии с большинством предыдущих исследований (1,2), ни глюкозо-индуцированный, ни индуцированный монометиловым эфиром янтарной кислоты биосинтез проинсулина нельзя отнести к положительной обратной связи секретируемого инсулина на β-клетке.Ингибирование индуцированного глюкозой и индуцированного монометиловым эфиром янтарной кислоты высвобождения инсулина за счет истощения запасов кальция или добавления соматостатина не влияло на стимуляцию биосинтеза проинсулина в тех же самых островках. Таким образом, более вероятно, что индуцированный сукцинатом биосинтез проинсулина был прямым следствием повышенного метаболизма сукцината. Интересно, что малонат, ингибитор фермента FAD-связанной сукцинатдегидрогеназы в комплексе II цепи переноса электронов (29), потенцировал стимулированный глюкозой биосинтез проинсулина в зависимости от дозы, тогда как он не влиял на стимулированную глюкозой секрецию инсулина. , общий синтез белка или содержание островкового АТФ.Индуцированное малонатом специфическое ингибирование сукцинатдегидрогеназы может приводить к накоплению внутриклеточного сукцината в островковых β-клетках и, следовательно, к усилению стимулируемого глюкозой биосинтеза проинсулина. Отсутствие эффекта малоната при концентрациях> 1 ммоль / л, вероятно, будет результатом дополнительного ингибирования экспорта сукцината из митохондрий, поскольку и сукцинат, и малонат являются субстратами одного и того же переносчика дикарбоновой кислоты (39,40). Таким образом, данные согласуются с идеей, что не только повышенная генерация митохондриального сукцината, но и его экспорт из митохондрий β-клеток в цитозольный компартмент важны для сигнала метаболического связывания, специфичного для биосинтеза проинсулина.Это важное соображение, потому что метаболический вторичный сигнал для биосинтеза проинсулина должен связываться с механизмом контроля трансляции синтеза белка, присутствующим в цитозоле β-клеток (1).

Как кандидат в метаболический фактор сопряжения для индуцированного глюкозой синтеза проинсулина, внутриклеточный сукцинат должен увеличиваться при повышении уровня глюкозы. Действительно, в этом исследовании глюкоза вызвала значительное увеличение общего содержания островков сукцината, тогда как содержание малата не изменилось.Кроме того, внутриклеточная концентрация сукцината в островках была вдвое выше, чем у малата, а внутриклеточные уровни фумарата были вне пределов обнаружения и поэтому были очень низкими. Это свидетельствует о том, что каталитическая стадия сукцинатдегидрогеназы в цикле Кребса митохондрий β-клеток является лимитирующей точкой. Однако малонат в концентрации, которая усиливала стимулируемый глюкозой биосинтез проинсулина, не приводил к дальнейшему повышению уровня сукцината, повышенного глюкозой. Тем не менее, это можно объяснить динамическим потоком сукцината в сукцинил-КоА.Наличие ферментативной активности в цитозоле островковых клеток, который способен синтезировать сукцинил-КоА специфически из сукцината (но не из ацетата, ацетил-КоА, ацетоацетата или ацетоацетил-КоА), открывает возможность увеличения цитозольного сукцинил-КоА, действующего как сигнал метаболического связывания, специфичный для индуцированного глюкозой увеличения биосинтеза проинсулина. Было показано, что глюкоза увеличивает уровни сукцинил-КоА в перифузированных островках крысы (26) и в клональной линии β-клеток поджелудочной железы HIT (12). Интересно, что уровни малонил-КоА, который, как предполагается, является сигналом, связывающим стимул с глюкозой для секреции инсулина (12,13), были максимально увеличены после 10-минутного воздействия глюкозы, тогда как рост уровней сукцинил-КоА был медленнее, с максимум достигается через 30 мин.Следует отметить, что кинетический ответ β-клетки на глюкозу быстрее при стимуляции секреции инсулина (~ 2 мин), чем при биосинтезе проинсулина, который имеет период задержки от 15 до 20 мин (20, 41). . Таким образом, кинетика индуцированного глюкозой повышения уровней сукцинил-КоА совместима с активацией биосинтеза проинсулина на уровне трансляции, а не секреции инсулина.

Таким образом, эти данные подтверждают мнение о том, что сукцинат накапливается в митохондриях β-клеток как следствие повышенного метаболизма глюкозы и экспортируется в цитозоль, где он превращается в сукцинил-КоА и затем может действовать в качестве связующего со стимулом вторичный сигнал для индуцированного глюкозой биосинтеза проинсулина.Такая гипотеза интригует, но требует дальнейших экспериментов для подтверждения. Тем не менее, мы предлагаем сукцинат и / или сукцинил-КоА в качестве наиболее многообещающих кандидатов для передачи сигнала метаболического стимула, специфичного для индуцированного глюкозой биосинтеза проинсулина. Исходя из этой предпосылки, можно предположить, что хроническая гипергликемия может приводить к стойкому накоплению сукцината / сукцинил-КоА, что, в свою очередь, может вызывать нарушение регуляции биосинтеза проинсулина, наблюдаемое при диабете 2 типа.Такой сценарий мог бы объяснить заметное увеличение базального биосинтеза проинсулина, наблюдаемое в изолированных островках гипергликемической модели диабета 2 типа на крысах (42). Кроме того, это исследование представляет новую точку расхождения в передаче сигналов стимула для индуцированного глюкозой биосинтеза проинсулина по сравнению с секрецией инсулина на уровне анаплероза, ниже гликолиза и выше окислительного фосфорилирования, где сукцинат будет предпочтительным специфическим анаплеротическим сигналом. для регулирования биосинтеза проинсулина, индуцированного глюкозой.

РИС. 1.

Влияние различных эфиров карбоновых кислот на биосинтез проинсулина изолированных островков крыс, общий синтез белка, секрецию инсулина и содержание АТФ. Островки предварительно инкубировали в течение 1 ч в отсутствие глюкозы или любого другого агента, а затем инкубировали в течение 1 ч при базальной (2,8 ммоль / л) глюкозе (G2.8), стимулирующей (16,7 ммоль / л) глюкозе (G16.7), или 20 ммоль / л указанного эфира карбоновой кислоты. Биосинтез проинсулина ( A ) определяли в иммунопреципитатах [ ³⁵ S] метионинового радиоактивно меченного экстракта островков с помощью денситометрического сканирования флюорографов PAGE с щелочной мочевиной.Типичный флюорограф показан вверху. Столбцы представляют собой средние значения ± стандартная ошибка денситометрического анализа более трех независимых экспериментов. Общий синтез белка ( B ) рассчитывали как осаждаемую TCA радиоактивность в 5-мкл аликвоте радиоактивно меченного островкового экстракта [ ³⁵ S] метионина. Секрецию инсулина ( C ) определяли в среде инкубации островков с помощью радиоиммуноанализа. Результаты представляют собой средние значения ± стандартная ошибка 6–19 отдельных экспериментов. Содержание островкового АТФ ( D ) измеряли как АТФ-зависимую активность люциферазы в лизатах временных островков, экспрессирующих люциферазу.Результаты представляют собой средние значения ± стандартная ошибка от четырех до шести экспериментов. Значения показаны как кратность стимуляции по сравнению с базальным уровнем глюкозы 2,8 ммоль / л. E-CIT, триэтиловый эфир лимонной кислоты; E-FUM, моноэтиловый эфир фумаровой кислоты; E-OAA, диэтиловый эфир щавелевоуксусной кислоты; G0 — отсутствие глюкозы или другого агента; M-MAL, диметиловый эфир яблочной кислоты; M-SUC, монометиловый эфир янтарной кислоты. * P <0,01 и ** P <0,05 по сравнению с 2,8 ммоль / л глюкозы.

РИС. 2.

Влияние истощения Ca ²⁺ и соматостатина (1 мкмоль / л) на уровень мРНК препроинсулина островков, стимулированный глюкозой и метиловым эфиром янтарной кислоты, биосинтез проинсулина и секрецию инсулина.Изолированные островки предварительно инкубировали в течение 1 ч при базальной (2,8 ммоль / л) глюкозе, а затем инкубировали в течение 1 ч при указанных условиях. Уровни мРНК островкового препроинсулина ( A ) определяли с помощью анализа защиты от РНКазы, как описано ранее (22). Показаны контрольные уровни мРНК GAPDH. Биосинтез проинсулина ( B ) и секрецию инсулина ( C ) измеряли, как указано в легенде на фиг.1. Результаты представляют собой средние значения ± стандартная ошибка трех независимых экспериментов. * P <0,02 vs.16,7 ммоль / л глюкозы в присутствии Ca ²⁺ ; # P <0,05 по сравнению с метиловым эфиром янтарной кислоты (M-SUC) 20 ммоль / л в присутствии Ca ²⁺ .

РИС. 3.

Влияние метилового эфира глутаминовой кислоты на биосинтез проинсулина, секрецию инсулина и содержание АТФ в изолированных островках. Островки предварительно инкубировали в течение 1 ч в отсутствие глюкозы, а затем инкубировали в течение 1 ч при возрастающих концентрациях глюкозы в отсутствие (•) или в присутствии 5 ммоль / л (▪) или 20 ммоль / л () метилового эфира глутаминовой кислоты.Биосинтез проинсулина ( A , сплошные линии), общий синтез белка ( A , пунктирные линии), секреция инсулина ( B ) и содержание АТФ ( C ) были определены в лизатах островков или в среде инкубации островков, как указано. в легенде рис. Результаты представляют собой средние значения ± стандартная ошибка от трех до девяти независимых экспериментов.

РИС. 4.

Дозозависимый эффект олигомицина на стимулированный глюкозой биосинтез проинсулина, общий синтез белка, секрецию инсулина и содержание АТФ в изолированных островках крысы.Островки предварительно инкубировали в течение 1 ч при базальной (2,8 ммоль / л) глюкозе, а затем инкубировали в течение 1 ч в присутствии 16,7 ммоль / л глюкозы и указанной концентрации олигомицина. Биосинтез проинсулина ( A ), общий синтез белка ( B ), секреция инсулина ( C ) и содержание АТФ ( D ) определялись в лизатах островков или в среде инкубации островков, как указано в легенде на рис. дизайн и методы исследования. Результаты представляют собой средние значения ± стандартная ошибка от трех до семи независимых экспериментов.

РИС. 5. Дозозависимый эффект

малоната на стимулированный глюкозой биосинтез проинсулина, общий синтез белка, секрецию инсулина и содержание АТФ в изолированных островках крысы. Островки предварительно инкубировали в течение 1 ч при базальной (2,8 ммоль / л) глюкозе, а затем инкубировали в течение 1 ч в присутствии 16,7 ммоль / л глюкозы плюс указанная концентрация метилового эфира малоновой кислоты (М-малонат). Биосинтез проинсулина ( A ), общий синтез белка ( B ), секреция инсулина ( C ) и содержание АТФ ( D ) определяли в лизатах островков или в средах для инкубации островков, как показано на фиг.1 легенда, дизайн и методы исследования. Результаты представляют собой средние значения ± стандартная ошибка от трех до восьми независимых экспериментов. * P <0,05 по сравнению с глюкозой 16,7 ммоль / л.

РИС. 6. Анализ методом ВЭЖХ

образования сукцинил-КоА из сукцината фракцией островкового цитозоля. Реакцию сукцината на сукцинил-КоА проводили при 30 ° C в присутствии ~ 8 мг белка фракции островкового цитозоля, 0,1 ммоль / л CoA, 10 ммоль / л Mg ²⁺ и 0,1 ммоль / л GTP. A : Время реакции = 0 мин. B : Время реакции = 5 мин. C : Время реакции = 5 мин, в отсутствие GTP. Продукты реакции анализировали на обращенно-фазовой колонке Whatman EQC C-18 5 мкм в следующем градиенте: 0–5% раствор B за 7 мин, 5–12% раствор B за 13 мин, 12–20% раствор B более 10 мин, 20–25% раствор Б более 10 мин, 25% раствор Б более 10 мин. Раствор B: 40% ацетонитрил в 0,1 моль / л KH ₂ PO ₄ , pH 5. Стрелки указывают время элюирования стандартов: CoA (1 и 5), сукцинил-CoA (2), ацетил-CoA (3 ) и ацетоацетил-КоА (4).OD, оптическая плотность.

ТАБЛИЦА 1

IC ₅₀ ингибиторов окислительного фосфорилирования

ТАБЛИЦА 2

Содержание сукцината и малата в глюкозо-стимулированных островках поджелудочной железы крыс

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами Национального института здравоохранения DK47919 и Канадским институтом DK50610 Исследования в области здравоохранения и международная стипендия Фонда детского диабета BW М.П. является ученым Канадского института исследований в области здравоохранения.

Мы благодарим Dr.Джуду Дини и Вере Шульц за их отличную помощь в анализе содержания островков сукцината, фумарата и малата.

Сноски

• Переписка и запросы на перепечатку направлять Кристоферу Дж. Родсу, Тихоокеанский Северо-Западный научно-исследовательский институт, 720 Бродвей, Сиэтл, Вашингтон 98122. Электронная почта: cjr {at} pnri.org.

  Получено для публикации 3 августа 2001 г. и принято в доработке 24 апреля 2002 г.

  DNP, динитрофенол; GDH, глутаматдегидрогеназа; ВЭЖХ, высокоэффективная жидкостная хроматография; IC ₅₀ , полумаксимальная ингибирующая концентрация; K _ATP -канал, ATP-чувствительный канал K ⁺ ; KRBH, бикарбонатный буфер Кребса-Рингера с HEPES; ЛДГ, лактатдегидрогеназа; SCS, сукцинил-КоА синтетаза; TCA, трихлоруксусная кислота.

• ДИАБЕТ

ССЫЛКИ

1. ↵

   Rhodes CJ: Обработка молекулы инсулина. Сахарный диабет: фундаментальный и клинический текст, 2-е изд. LeRoith D, Taylor SI, Olefsky JM, Eds. Филадельфия, Lippincott Williams & Wilkins, 2000 г. , стр.20 –38

2. ↵

   Levy J, Malaisse WJ: Связь стимул-секреция индуцированного глюкозой высвобождения инсулина. XVII. Влияние сульфонилмочевины и диазоксида на биосинтетическую активность островков.Biochem Pharmacol24 : 235 –239,1975

3. ↵

   Skelly RH, Bollheimer LC, Wicksteed BL, Corkey BE, Rhodes CJ: явное различие в путях связывания метаболических стимулов и ответов для регуляции биосинтеза проинсулина и секреции инсулина, которое находится на уровне потребность в жирных ацильных остатках. Биохим J331 : 553 –561,1998

4. ↵

   Bollheimer LC, Skelly RH, Chester MW, McGarry JD, Rhodes CJ: Хроническое воздействие свободных жирных кислот снижает содержание инсулина в бета-клетках поджелудочной железы за счет увеличения секреции базального инсулина, которая не компенсируется соответствующее увеличение трансляции биосинтеза проинсулина.Дж Клин Инвест101 : 1094 –1101,1998

5. ↵

   Это К., Цубамото Y, Тераучи Y, Сугияма Т., Кишимото Т., Такахаси Н., Ямаути Н., Кубота Н., Мураяма С., Айзава Т., Аканума Ю., Айзава С., Касаи Х., Yazaki Y, Kadowaki T: Роль системы шаттла NADH в индуцированной глюкозой активации митохондриального метаболизма и секреции инсулина. Наука283 : 981 –985,1999

6. Ishihara H, Wang H, Drewes LR, Wollheim CB: Сверхэкспрессия транспортера монокарбоксилата и лактатдегидрогеназы изменяет секреторные ответы инсулина на пируват и лактат в бета-клетках.Дж Клин Инвест104 : 1621 –1629,1999

7. ↵

   Ainscow EK, Zhao C, Rutter GA: Острая сверхэкспрессия лактатдегидрогеназы-A нарушает митохондриальный метаболизм бета-клеток и секрецию инсулина. Диабет49 : 1149 –1155,2000

8. ↵

   Прентки М., Торнхейм К., Корки Б. Е.: Механизмы передачи сигнала при секреции инсулина, индуцированной питательными веществами. Diabetologia40 (Приложение 2) : S32 –S41,1997

9. ↵

   Прентки М.: Новые сведения о метаболических сигналах β-клеток поджелудочной железы при действии инсулина.Eur J Endocrinol134 : 272 –286,1996

10. MacDonald MJ: Глюкоза входит в метаболизм митохондрий посредством карбоксилирования и декарбоксилирования пирувата в островках поджелудочной железы. Обмен веществ42 : 1229 –1231,1993

11. Schuit F, De Vos A, Farfari S, Moens K, Pipeleers D, Brun T, Prentki M: метаболическая судьба глюкозы в очищенных островковых клетках: регулируемый глюкозой анаплероз в бета-клетках. J Biol Chem272 : 18572 –18579,1997

12. ↵

    Corkey BE, Glennon MC, Chen KS, Deeney JT, Matschinsky FM, Prentki M: роль малонил-КоА в стимулированной глюкозой секреции инсулина из клональных бета-клеток поджелудочной железы.J Biol Chem264 : 21608 –21612,1989

13. ↵

    Prentki M, Vischer S, Glennon MC, Regazzi R, Deeney JT, Corkey B: эфиры малонил-КоА и длинноцепочечных ацил-КоА в качестве факторов метаболического связывания в секреции инсулина, индуцированной питательными веществами. J Biol Chem267 : 5802 –5810,1992

14. ↵

    Фарфари С., Шульц В., Корки Б., Прентки М.: Глюкозо-регулируемый анаплероз и катаплероз в бета-клетках поджелудочной железы: возможное участие пирувата / цитрата в секреции инсулина.Диабет49 : 718 –726,2000

15. ↵

    Corkey BE, Deeney JT, Yaney GC, Tornheim K, Prentki M: Роль длинноцепочечных сложных эфиров ацил-КоА с длинной цепью в передаче сигнала бета-клеток. J Nutr130 (Приложение 2) : 299S –304S, 2000

16. ↵

    Maechler P, Wollheim CB: Митохондриальный глутамат действует как посредник в индуцированном глюкозой экзоцитозе инсулина. Природа402 : 685 –689,1999

17. ↵

    Сенер А., Конге I, Расшерт Дж., Леклерк-Мейер В., Вильянуэва-Пенакаррильо М.Л., Вальверде I, Малайсс В.Дж.: Инсулинотропное действие диметилового эфира глутаминовой кислоты.Am J Physiol267 : E573 –E584,1994

18. ↵

    MacDonald MJ, Fahien LA: Глутамат не является посредником в секреции инсулина. J Biol Chem275 : 34025 –34027,2000

19. ↵

    Guest PC, Rhodes CJ, Hutton JC: Регулирование биосинтеза белков инсулино-секреторных гранул: координированный контроль трансляции осуществляется на некоторых, но не на всех, составляющих матрикса гранул. Биохим J257 : 431 –437,1989

20. ↵

    Alarcon C, Lincoln B, Rhodes CJ: Биосинтез связанной с субтилизином пропротеин-конвертазы PC3, но не PC2-конвертазы, регулируется глюкозой параллельно с биосинтезом проинсулина у крыс. островки поджелудочной железы.J Biol Chem268 : 4276 –4280,1993

21. ↵

    Kohler M, Norgren S, Berggren PO, Fredholm BB, Larsson O, Rhodes CJ, Herbert TP, Luthman H: Изменения в цитоплазматической концентрации АТФ параллельны изменениям в АТФ-регулируемой активности K + -каналов в инсулин-секретирующих клетках. FEBS Lett441 : 97 –102,1998

22. ↵

    Викстид Б., Герберт Т.П., Аларкон С., Лингор М.К., Мосс Л.Г., Родс С.Дж .: Для стимулированной глюкозой трансляции необходимо взаимодействие между нетранслируемыми участками мРНК препроинсулина.J Biol Chem276 : 22553 –22558,2001

23. ↵

    Maechler P, Wang H, Wollheim CB: Непрерывный мониторинг уровней АТФ в живых клетках секреции инсулина, экспрессирующих цитозольную люциферазу светлячков. FEBS Lett422 : 328 –332,1998

24. ↵

    Williamson JR, Corkey BE: Анализ промежуточных продуктов цикла лимонной кислоты и родственных соединений. Методы Enzymol13 : 433 –513,1969

25. ↵

    Labarca C, Paigen K: простая, быстрая и чувствительная процедура анализа ДНК.Анальный biochem102 : 344 –352,1980

26. ↵

    Liang Y, Matschinsky FM: Содержание CoA-эфиров в перифузированных островках крысы, стимулированных глюкозой и другими видами топлива. Диабет40 : 327 –333,1991

27. ↵

    Rognstad R: Глюконеогенез в гепатоцитах крысы из монометилсукцината и других сложных эфиров. Arch Biochem Biophys230 : 605 –609,1984

28. ↵

    Отеро М.Дж., Карраско Л.: Действие олигомицина на культивируемые клетки млекопитающих: повышение проницаемости для ингибиторов трансляции.Mol Cell Biochem61 : 183 –191,1984

29. ↵

    Акрелл Б.А., Кирни Э.Б., Зингер Т.П .: Сукцинатдегидрогеназа млекопитающих. Методы Enzymol53 : 466 –483,1978

30. ↵

    Kowluru A: Аденин- и гуанин-нуклеотид-специфическая сукцинил-КоА синтетаза в митохондриях клональных бета-клеток: влияние на метаболизм высокоэнергетических фосфатов бета-клеток по отношению к физиологической секреции инсулина. Диабетология44 : 89 –94,2001

31. ↵

    Оттавей Дж. Х., Макклеллан Дж. А., Сондерсон К. Л.: Янтарная тиокиназа и метаболический контроль.Int J Biochem13 : 401 –410,1981

32. ↵

    Санти Д.В., Вебстер Р.В. мл., Клеланд В.В.: Кинетика аминоацил-тРНК синтетаз, катализируемых обменом АТФ-PPi. Методы Enzymol29 : 620 –627,1974

33. ↵

    Пеллетье Дж., Соненберг Н.: Участие вторичной структуры мРНК в синтезе белка. Биохимическая клетка Biol65 : 576 –581,1987

34. ↵

    Финкель Т. Активные формы кислорода и преобразование сигналов. IUBMB Life52 : 3 –6,2001

35. ↵

    Gembal M, Gilon P, Henquin JC: Доказательства того, что глюкоза может контролировать высвобождение инсулина независимо от ее действия на АТФ-чувствительные K + каналы в B-клетках мыши.J Clin Invest89 : 1288 –1295,1992

36. ↵

    Komatsu M, Schermerhorn T, Aizawa T., Sharp GW: Стимуляция глюкозой высвобождения инсулина в отсутствие внеклеточного Ca2 + и при отсутствии какого-либо увеличения внутриклеточного Ca2 + в островках поджелудочной железы крыс. Proc Natl Acad Sci U S A92 : 10728 –10732,1995

37. ↵

    Fahien LA, MacDonald MJ, Kmiotek EH, Mertz RJ, Fahien CM: Регулирование высвобождения инсулина факторами, которые также изменяют глутаматдегидрогеназу.J Biol Chem263 : 13610 –13614,1988

38. ↵

    MacDonald MJ, Fahien LA, Mertz RJ, Rana RS: Влияние сложных эфиров янтарной кислоты и других промежуточных продуктов цикла лимонной кислоты на высвобождение инсулина и образование инозитолфосфата островками поджелудочной железы. Arch Biochem Biophys269 : 400 –406,1989

39. ↵

    Робинсон Б. Х., Уильямс Г. Р.: Чувствительность реакций обмена дикарбоксилат-аниона на транспортные ингибиторы в митохондриях печени крысы. Biochim Biophys Acta216 : 63 –70,1970

40. ↵

    Каплан Р.С., Педерсен П.Л.: Выделение и восстановление чувствительного к н-бутилмалонату переносчика дикарбоксилата из митохондрий печени крысы.J Biol Chem260 : 10293 –10298,1985

41. ↵

    Гродски Г.М.: Кинетика секреции инсулина. В Сахарный диабет: фундаментальный и клинический текст. 2-е изд. LeRoith D, Taylor SI, Olefsky JM, Eds. Филадельфия, Lippincott Williams & Wilkins, 2000 г. , стр.2 –11

42. ↵

    Alarcon C, Leahy JL, Schuppin GT, Rhodes CJ: Повышенная секреторная потребность, а не дефект в механизме превращения проинсулина, вызывает гиперпроинсулинемию в модели инсулиннезависимого сахарного диабета на крысах, получавших инфузию глюкозы. .J Clin Invest95 : 1032 –1039,1995

Прикладная микробиология | Бесплатный полнотекстовый | Хорошее знание физиологии сукциногенов Actinobacillus для увеличения производства янтарной кислоты

3.1. Результаты для реакторов со встряхиваемой колбой объемом 250 мл, использующих глюкозу в качестве источника углерода в микроаэробных и анаэробных условиях

Ферментация A. succinogenes в микроаэробных условиях не показала продукции СК, в то время как она показала низкие выходы ( ^-1 глюкозы. использовался в качестве единственного источника углерода в анаэробных условиях, СК производилась на низких уровнях, записывая значение 0.01 моль л ⁻¹ (рис. 1а). Дальнейшие доказательства представлены в предыдущем исследовании [28,29], демонстрирующем, что СК образуется даже тогда, когда этот субстрат был добавлен в качестве единственного углеродного сырья в анаэробных условиях. Кроме того, A. succinogenes не может продуцировать СК в синтетической среде, содержащей глюкозу в качестве единственного источника углерода в микроаэробных и аэробных условиях [30]. Выход биомассы был менее 0,03 г-DCW / г-GLU, в то время как аналоги, работающие с другими концентрациями глюкозы, показали более высокие выходы биомассы (> 0.06 г-DCW / г-GLU). Для улучшения процесса была проведена серия экспериментов на синтетической среде. Было проверено, что MgCO ₃ является ключевым фактором производства СК [31], и, следовательно, он был добавлен в ферментационную среду в качестве нейтрализатора и для перенаправления метаболического потока при концентрации 0,1 моль л ^-1 . Рисунок 1b иллюстрирует рисунок 1b. результаты, полученные в ходе экспериментов по периодической ферментации в небольших анаэробных реакторах (колба 250 мл) во время ферментации в присутствии MgCO ₃ .Ферментации проводили с различными количествами начальной концентрации глюкозы (0,05, 0,19 и 0,26 моль л ^-1 ). Как показано на рисунке 1b, концентрация СК достигает максимального значения и составляет рекордные 0,14 моль · л ^-1 , кроме того, выход и производительность увеличились в 3,5, 0,8 раза и показали максимальные значения 0,93 мольС-СК / мольС-GLU, 0,17 г-СК. / Л / ч, соответственно, по сравнению с результатами, полученными в отсутствие MgCO ₃ (рис. 1а). Кроме того, выход биомассы увеличился с 0.От 02 г-DCW / г-GLU до 0,05 г-DCW / г-GLU. Добавление MgCO ₃ было полезным для увеличения выхода биомассы и синтеза янтарной кислоты. Это может быть связано с необходимостью использования CO ₂ и кофактора Mg ²⁺ , предоставляемого MgCO ₃ для пути преобразования в биомассу и продукты. Как показано на рисунке 1c, дальнейшего значительного увеличения концентрации сукцината не наблюдалось. , выход и продуктивность в конце экспериментов при добавлении 0,26 моль л глюкозы ¹ .Zou et al. [32] впервые сообщили о замене газа CO ₂ на MgCO ₃ при ферментации SA. Теоретически 1,71 моль SA производится на моль глюкозы в присутствии источников CO ₂ на основе доступных электронов согласно следующему уравнению (уравнение (1)) [33]:

Глюкоза + 0,86 HCO3- → 1,71 сукцинат2- + 1,74 ч3O + 2,58 H +

(1)

Экспериментальные урожаи могут быть ограничены используемыми способами и углеродом, превращенным в биомассу и альтернативные продукты.Молярный выход, полученный в экспериментах, представленных на рисунке 1b, составлял около 0,84 моль SA / моль глюкозы.

Был рассчитан процент выхода, который составляет 49%, что означает, что 49% глюкозы преобразовалось в СК после 48 часов ферментации.

Когда был добавлен MgCO ₃ , HCO ₃ ^— , CO ₃ ^2- и CO ₂ пришли бы в равновесие в ферментационном бульоне в соответствии со следующими уравнениями:

MgCO3 → Mg2 + + CO32−

(2)

H + + CO32− ↔ HCO3 − A = π

(3)

H + + HCO3− ↔ h3CO3

(4)

Следовательно, нерастворимая добавка MgCO ₃ вызвала мутный бульон, распространение клеток, что предотвращает флокуляцию клеток, и действительно увеличивает растворенные концентрации HCO ₃ ^— , CO ₃ ^2- и CO ₂ в бульон, который влияет на поток углерода и активность фермента фосфоенолпируваткарбоксикиназы, чтобы перенаправить поток в сторону биосинтеза СК [15], и благодаря этим свойствам MgCO ₃ играет важную роль в улучшении продукции СК.Анализ концентрации MgCO ₃ в конце ферментации зафиксировал значение 0,016 моль л ^-1 , что означает, что карбонатные минералы были израсходованы по сравнению с начальной концентрацией карбоната. Однако MgCO ₃ нельзя было использовать в качестве донора CO ₃ ^2-, потому что немногие отчеты показывают, что CO ₃ ^2- непосредственно используется в качестве субстрата микроорганизмами, продуцирующими СК [32].

3.2. Результаты для 250 мл анаэробных бутылок с использованием единственного и смешанного сахара в качестве источника углерода в анаэробных условиях

Профиль ферментации системы фруктоза-SA показан на рисунке 2.SA была основным продуктом, представленным в СМИ. Более того, ни в одном образце не было обнаружено ни этанола, ни молочной кислоты. Урожайность, продуктивность, изменение оптической плотности клеток и концентрации сукцината в конце периода ферментации для нескольких концентраций субстрата показаны в таблице 1. Фруктоза потреблялась в основном в течение первых 48 часов. Наивысший выход углерода (С-моль / С-моль) был обнаружен при начальных концентрациях фруктозы 0,15 моль · л ^-1 с максимальным значением 0,92 моль C-SA / моль C-FRU.Это, скорее всего, должно быть связано с сильно сниженным состоянием глюкозы и фруктозы в дополнение к глицерину, который, в отличие от других сахаров, способствует образованию СК [34]. Предыдущие исследования также указали на высокий выход продукции СК при использовании мутантных бактериальных штаммов [4,35,36]. Была оценена возможность производства СК с помощью A. succinogenes с одновременным использованием глюкозы и фруктозы в качестве источников углерода. Комбинируя эти два сахара, они потребляются быстрее, чем при использовании одного сахара (рис. 3а).Более того, мы демонстрируем, что процесс может адаптироваться к изменению концентрации этих двух сахаров. Пока в среде присутствует субстрат, биомасса растет экспоненциально примерно до 70 часов; затем из-за ограничения субстрата биомасса переходит в стационарную фазу. Наибольшее образование СК при совместной ферментации составило 0,22 моль л / л ^-1 (что эквивалентно выходу 0,94 моль С-СК / моль С-сахаров и продуктивности СК 0,27 г-СК / л / ч), наблюдаемой в смеси с соотношение 50% фруктозы и 50% глюкозы в присутствии 0.2 моль л ⁻¹ MgCO ₃ (рис. 3б). Присутствие 0,2 моль л ^-1 MgCO ₃ было полезным для стимулирования продукции СК и обеспечения максимальной концентрации СК (0,22 моль л ^-1 ). По этой причине MgCO ₃ при 0,2 моль л ^-1 рассматривался в дальнейшем (рисунок 3c).

3.3. Улучшение продукции янтарной кислоты путем добавления медиатора в 250 мл анаэробные бутылки

Большинство опубликованных исследований по улучшению продукции SA у A.succinogenes сосредоточены на манипулировании активностью ферментов посредством делеции конкурирующих путей и / или сверхэкспрессии полезных путей с использованием генетических инструментов [1,37,38]. Следовательно, целью этого исследования было получение избыточного количества сукцината из A. succinogenes путем увеличения активности фумаратредуктазы путем добавления восстановленных медиаторов, которые переносят электроны в бактериальные клетки и действуют как донор электронов для фумаратредуктазы. Восстановление и окисление между фумаратом и сукцинатом должно создать петлю в цикле TCA.Мы работали над доступностью различных концентраций фумарата, и наша концепция заключалась в том, чтобы доказать его действие в качестве посредника. В таблице 2 представлено влияние различных исходных концентраций фумарата на потребление сахаров, pH, образование СК, выходы, продуктивность и относительный процент янтарной кислоты.

Уменьшение pH было связано с диссоциированной формой ЖК, которая изначально была добавлена ​​в среду. Результаты показывают, что при увеличении концентрации FA чистое производство SA было выше на 28% по сравнению с экспериментом, проведенным без FA.Кроме того, увеличились выход и продуктивность производства СК, достигнув 0,62 моль-С СК / моль-С сахаров и 0,23 г л ^-1 ч ^-1 , соответственно, при концентрации СК до 0,23 моль л ^-1 ат. конец брожения (120 ч). Фумаратредуктаза играет ключевую роль, поскольку она позволяет электронам переноситься от восстановленного медиатора в бактериальные клетки. Один из сценариев состоит в том, что фумарат адсорбируется на внутренней мембране и переносит электроны на фумаратредуктазу, производящую сукцинат.

A. succinogenes является продуцентом сукцината дикого типа, который продуцирует SA анаэробно через восстановительную ветвь цикла TCA [39]. Производство сукцината в результате анаэробного роста с помощью C ₄ -дикарбоксилатов, таких как фумарат, требует транспортеров, катализирующих поглощение и отток C ₄ -дикарбоксилатов. В результате было выполнено множественное выравнивание последовательности (MSA) белковой последовательности с использованием баз данных UNIPROT с белковой последовательностью, обнаруженной в E. coli, которая требует транспортеров для поглощения фумарата, показало, что A.сукциногены имеют транспортную систему из 3 транспортеров для поглощения фумарата и экспрессируются во время анаэробного роста на фумарате; это: Asuc_1063, Asuc_1999 и Asuc_0142.A. succinogenes хорошо растет на C ₄ -дикарбоксилатах, таких как фумарат, в анаэробных условиях. Поставляемый фумарат почти превращается в сукцинат, и более 90% поставляемых сахаров также превращаются в сукцинат. Во всех тестируемых условиях, микроаэробных и анаэробных условиях с глюкозой и фруктозой или фумаратом, уровень SA был заметно улучшен в присутствии фумарата (см. Таблицу 3) по сравнению с ферментацией с использованием сахаров C ₆ , что привело к SA концентрация около 0.5 моль л ^-1 с экспериментальным выходом и производительностью 0,88 моль-С / моль-С, 0,48 г л ^-1 ч ^-1 соответственно. Анаэробный рост фумарата стимулировался переносчиком, и основным продуктом был сукцинат с выходом конверсии 95,4%, что указывает на участие поглощения фумарата в продукции СК, аналогично продукции сукцината из глюкозы и фруктозы. Поглощение фумарата 0,0008 мол. L ^-1 показывает, что системы обладают субстратной специфичностью к фумарату, но не к сукцинату.

3.4. Превращение ЖК в янтарную кислоту в Actinobacillus succinogenes

В этом исследовании были проведены различные тесты периодической ферментации в 250 мл анаэробных бутылях, содержащих глюкозу, фруктозу и ЖК в разных количествах, среди которых концентрации глюкозы и фруктозы были равными. С другой стороны, для ферментации SA использовали смоделированную среду, содержащую FA, как описано ранее, за исключением смешанных сахаров. В этом случае были выбраны периодические испытания ферментации для сравнения с ферментационной способностью одноуглеродного сырья (FA).Каждый источник углерода был добавлен для поддержания постоянного количества углерода. Глюкоза, фруктоза и ЖК были почти израсходованы в конце ферментации (Таблица 4). Произведенная дополнительная SA обычно соответствует израсходованной FA, добавленной в среду с процентом ошибок (Таблица 4). Первый запуск соответствовал контрольным экспериментам, проведенным без добавления FA. В этом эксперименте полученная концентрация SA составляла около 0,053 моль · л ^-1 . Однако максимальная полученная концентрация SA (запуск 3) была приблизительно равна 0.24 моль л ^-1 , с почти такой же производительностью (0,25 г л ^-1 ч ^-1 ), что соответствует потреблению сахаров и ЖК. В соответствии с этим, израсходованная ЖК составляла 0,192 моль л ^-1 , а затем дополнительная СК, произведенная из ЖК, по сравнению с контрольным циклом составила 0,187 моль л ^-1 с процентом ошибки 2,6%, что указывает на то, что можно использовать ЖК. непосредственно производить SA в присутствии смешанных сахаров. Концентрации СК составляли около 0,24 моль л ^-1 , 0,16 моль л ^-1 и 0.05 моль л ^-1 , полученный из исходной равной концентрации смеси глюкозы и фруктозы (0,05 моль л ^-1 ) с 0,2 моль л ^-1 , 0,1 моль л ^-1 или без ЖК , соответственно. Для ферментации с использованием ЖК в качестве единственного источника углерода концентрация и продуктивность СК были относительно низкими по сравнению с выходом конверсии. Однако, по сравнению с ферментацией с использованием глюкозы и фруктозы, ферментация с использованием 0,1 моль л ^-1 и 0,2 моль л ^{— 1} FA (опыты 4 и 5 соответственно) в качестве источника углерода привели к конечной концентрации SA около 0.08 моль л ⁻¹ и 0,14 моль л ⁻¹ соответственно. Эти испытания партии привели к выходу 0,94 и 0,74 мольC-SA / мольC-FA с 0,09 г л ^-1 ч ^-1 и 0,16 г л ^-1 ч ^-1 продуктивность SA соответственно, что подтверждает что углерод, полученный из FA, может быть использован для образования биомассы (роста) и имеет решающее значение и эффективно используется для получения SA во время ферментационной культуры. Фумаратредуктаза (FRD) — ключевой фермент, активируемый и синтезируемый в условиях низкого содержания кислорода.У Actinobacillus succinogenes фумаратредуктаза, индуцированная анаэробным ростом, экспрессируется на последней стадии анаэробной ферментации [28], позволяя высвободившимся электронам ожидающего фумарата превращаться в сукцинат анаэробным путем. Восстановление фумарата является основным источником сукцината во время ферментации и в анаэробных условиях оно строго требуется для образования сукцината [40]. Согласно метаболическому потоку сукциногенов Actinobacillus, OAA превращается в сукцинат через MAL и FUM в качестве промежуточных продуктов [41].Выход сукцината тесно связан с доступностью никотинамидадениндинуклеотида (НАДН) [42] и, следовательно, с фумаратом. Следовательно, распределение потока, которое поддерживает высокое присутствие фумарата и НАДН, свидетельствует в пользу продукции сукцината [43,44,45].

3.5. Анализ баланса массы (MBA)

MBA — это способ определить максимальные возможности организма в устойчивом состоянии для данного углеродного субстрата. Кроме того, MBA выгодны для распределения потоков, образования биомассы и синтеза метаболитов, и на них влияют условия окружающей среды.Точность данных была оценена путем выполнения общих массовых балансов, которые состоят из расчета стехиометрического количества субстратов, необходимых (в нашем случае глюкоза и фруктоза) для производства метаболита, на основе элементного баланса (Cin = Cout + Caccumulated) и сравнения этого количества ( теоретическое) к полученному (измеренному) количеству продуцируемых метаболитов. В таблице 5 представлена ​​кинетика нескольких прогонов ферментации с закрытием баланса массы. Поскольку глюкоза и фруктоза имеют одинаковое соотношение C, H и O, в расчетах они были объединены в одно количество, а минеральный углерод, полученный из MgCO ₃ , был исключен.Процентное завершение баланса масс рассчитывается как отношение произведенных экспериментальных C _SA и DCW к полученному количеству потребленных сахаров. Значение меньше 100 указывает на то, что было потреблено больше углерода, чем учтено для производства метаболитов и биомассы.

Максимальная производительность наблюдалась при испытании равной смеси сахаров с добавлением ЖК, зафиксировав значение 0,48 г л ^-1 ч ^-1 ; в то время как максимальный выход был получен при совместной ферментации, когда баланс массы составлял в среднем 82%.

На рис. 4 представлены массовые балансы при коферментации, которые в среднем приблизились к 79,9%, что свидетельствует о том, что было потреблено больше сахаров, чем произведено метаболитов. Образец, взятый в конце ферментации (96 ч), содержал 2,7% DCW, закрыл MBA до 82,1%, а остальные 17,9% были распределены между побочными продуктами, газом и летучими жирными кислотами (VFA). Неполное закрытие массовых балансов, приписываемое необнаруженным метаболитам, не умаляет актуальности полученных результатов для процесса. Запись баланса массы для каждого внутриклеточного метаболита приводит к сбору метаболических реакций и путей, происходящих в Actinobacillus succinogenes (см. Приложение A), чтобы понять механизм производства конечных продуктов и побочных продуктов.Природный штамм A. succinogenes продуцирует SA путем фосфоенолпирувата (PEP) и восстановительной ветви цикла TCA (путь C ₄ , рисунок 4). По этим путям НАДН полностью потреблялся; таким образом, поток в сторону SA ограничивается из-за удовлетворения потребности в окислительно-восстановительном балансе, приводящем к образованию побочных продуктов, таких как муравьиная и уксусная кислоты, через пируватный путь, чтобы сбалансировать углеродный метаболизм. Метаболизм пирувата A. succinogenes может происходить двумя разными путями, в частности, путями пируватформиат-лиазы (PFL) или пируватдегидрогеназы (PDH).Когда происходит поток PFL, Y _AAForA составляет 1,0 моль / моль, потому что ацетил-КоА, образующийся из пирувата, превращается в уксусную кислоту (рис. 4). Однако при использовании пути PDH вместо муравьиной кислоты образовывались CO ₂ и NADH; таким образом, Y _AAForA обращается в ноль, и выход дополнительной понижающей мощности (NADH) увеличивается. Аналогично, Y _AAForA становится нулевым, когда путь PFL происходит одновременно с формиатдегидрогеназой (FDH), что приводит к образованию CO ₂ и NADH в результате разложения муравьиной кислоты под действием FDH.При трансформации пирувата по пути PFL осуществляются следующие реакции:

Glu + 2CO2 + 2NADH → 2SA

(5)

Glu → 2AA + 2FA + 2NADH

(6)

Уравнение (5) представляет образование СК, а уравнение (6) указывает образование уксусной и муравьиной кислот. Интегрирование двух Уравнений (5) и (6) дает чистый окислительно-восстановительный баланс, Уравнение (7):

Glu + 2CO2 → 2SA + AA + FA

(7)

Теоретически образование биомассы считается нулевым, и весь углерод превращается в продукты.Уравнение (7) представляет теоретическое значение для Y _{SA, AA} , которое составляет 1,0 моль / моль = 1,97 г / г и 0,66 г / г для Y _{SA, Glu} . Когда пируват превращается через путь PDH, происходят следующие реакции:

2Glu + 4CO2 + 4NADH → 4SA

(8)

Glu → 2AA + 2CO2 + 4NADH

(9)

По сути, уравнение (8) представляет собой уравнение (5), умноженное на два, для соответствия требованиям окислительно-восстановительного потенциала, а уравнение (9) представляет производство уксусной кислоты.Как и выше, интегрирование уравнений (8) и (9) дает чистый окислительно-восстановительный баланс в уравнении (10):

3Glu + 4CO2 → 4SA + 2AA

(10)

Теоретически биомасса не образовывалась, и из уравнения (10) максимальное значение Y _{SA, AA} составляет 2,0 моль / моль, равное 3,93 г _SA / г _AA и 0,87 г / г для Y _{SA, Glu.} . Точно так же, когда PFL активен одновременно с FDH, муравьиная кислота может быть преобразована в CO ₂ и NADH, давая 3,93 г / г в качестве максимального значения для Y _{SA, AA} , когда рост биомассы и состояние поддержания незначительны.Когда образуется биомасса, часть субстрата (глюкоза и / или фруктоза) будет адресована потоку метаболизма биосинтеза, влияя таким образом на окислительно-восстановительный баланс с более низким выходом, чем упоминалось ранее. Максимальный выход, наблюдаемый в этом исследовании, (Y _{SA, S} ) достиг 0,79 г / г, что превышает теоретические выходы для глюкозы, фруктозы (0,66 г / г), но не для совместной ферментации с (1,02 г / г) или без добавления (1,12 г / г) ЖК. Наивысшие значения Y _{SA, S} , опубликованные при ферментации A. succinogenes, составили 0.76 г / г [47], 0,69 г / г [48], 0,59 г / г [49] и 0,94 г / г [50]. Следует отметить, что в большинстве случаев литература, относящаяся к ферментации A. succinogenes, потреблению сахара, концентрациям или выходам метаболитов, не представлена, и поэтому анализ метаболической сети не может быть оценен. Трансгидрирование, также называемое чистым образованием NADPH / NADH, связано с образованием биомассы и может объяснять окислительно-восстановительный дисбаланс. Чтобы уравновесить окислительно-восстановительный баланс, полезно определить избыточный «дополнительный» НАДН, необходимый при высоких значениях Y _{SA, AA} , в зависимости от потребности в субстрате.Выход «лишнего» НАДН выражается в молях НАДН, продуцированного на моль израсходованного субстрата, моль / моль (путь представлен на Фигуре 4). В нашем исследовании в конце ферментации потребление углеводов составило 69,84 г л ^-1 ч ^-1 и привело к 1,18 г л ^-1 DCW. Вилладсен и др. [51] предположили молекулярный состав биомассы (CH _1,8 O _0,5 N _0,2 ) и, исходя из метаболического пути, приведенного на рисунке 4, НАДН, образующийся при образовании биомассы (0.0027 моль / моль), через гликолиз (0,77 моль / моль) и через путь PDH / FDH (неизвестный в нашем случае), но теоретически (1 моль / моль) только 77,27% требуется для получения 58 г / л SA. «Дополнительный» НАДН подразумевает избыточную восстанавливающую способность, образованную биомассой и путём ПДГ / ФДГ, в целом можно считать дополнительный НАДН необходимым и доставленным для удовлетворения окислительно-восстановительного баланса. Во многих статьях сообщается о самом высоком выходе (Y _{SA, Glu} до 1,12 г / г) и обсуждается способность генерировать NADH из окислительной ветви цикла TCA с помощью глиоксилатного шунта, увеличивая тем самым поток пути C ₄ без образования побочных продуктов. [52].Тем не менее, функциональные ферменты цикла TCA, ведущие к глиоксилатному шунту (цитратсинтаза и изоцитратдегидрогеназа), отсутствуют у A. succinogenes [53]; следовательно, эти пути исключены как дополнительные источники НАДН. В исследовании, проведенном Rühl et al., [54], обсуждалась способность Bacillus subtilis поддерживать метаболическую активность при незначительном образовании биомассы, что приводит к переполнению НАДФН через путь пентозофосфата (PPP), который далее трансформируется. в НАДН через трансгидрогеназу.Точно так же, когда имеет место (PPP), углерод, произведенный из глюкозо-6-фосфата и / или фруктозо-6-фосфата, полностью рециркулируется и направляется по этому пути в A. succinogenes, которые обладают трансгидрогеназой, как упоминалось выше, что предполагает преобразование избытка НАДФН к НАДН. Настоящие чистые реакции могут произойти:

3Glu → 2CO2 + 8NADH + 4SA

(11)

12Glu + CO2 + NADH → SA

(12)

Уравнение (11) представляет SA, образованную посредством (PPP) окислительного пути, при условии, что глицеральдегид-3-фосфат (GA3P), образованный из (PPP), трансформируется в PEP с одним высвобождением NADH, а затем PEP направляется в SA посредством C _{. 4 путь} .Уравнение (12) представляет SA, образованную из восстановительной ветви цикла TCA. Комбинируя эти два уравнения, окислительно-восстановительный потенциал уравновешивается в следующей реакции:

7Glu + 6CO2 → 12SA

(13)

Из уравнения (13) SA по максимальному выходу глюкозы (Y _{SA, Glu} ) составляет 1,12 г / г, полученный без образования биомассы или побочных продуктов. Следовательно, максимизация выхода СК может быть достигнута с помощью активного окислительного PPP, поскольку он обеспечивает достаточную восстанавливающую способность и устраняет необходимость в пути C ₃ .Этот механизм может пролить свет на необнаруживаемые побочные продукты, наблюдаемые в этом исследовании. Другая часть опубликованных данных, касающихся периодической ферментации A. succinogenes [55,56], предполагает сдвиг распределения метаболического потока в пользу продукции СК, что отражается в снижении DCW. В настоящем исследовании выход Y _{SA, S} составлял от 0,16 г / г до 0,79 г / г, а расход субстрата — от 7,2 г на л ^-1 до 79,93 г на л ^-1 . DCW в разных ситуациях находились между (≈0 и 1.18 г L ^-1 ) и Y _{SA, X} также находился между 0,18 г / г и 0,65 г / г. Различия в степени означают различие в поведении A. succinogenes. При высокой концентрации SA уменьшение Y _{X, S} можно объяснить поддерживающим или нерастущим состоянием, применяемым клетками, как упомянуто выше. Представление о поддержании состояния A. succinogenes с множественными связями распределения потока обсуждается в [54]. Однако запрос PPP, когда он активен, требуется или нет.

3,7. Ферментация в настольных ферментерах (B-TF)

Прогоны ферментации также выполнялись в ферментере емкостью 3 л с рабочим объемом 1800 мл с использованием той же среды, что и в анаэробных бутылях на 250 мл. На рис. 6а показаны результаты аналогичных начальных концентраций сахаров (равная смесь глюкозы и фруктозы) с ЖК в качестве кофактора в конце экспериментов. Поддерживающее производство к концу ферментации идет медленно (рис. 6а), глюкоза и фруктоза потреблялись одновременно, однако в них присутствует значительное количество остаточных сахаров (0.01 моль л ⁻¹ ). Концентрация СК, полученная в конце ферментации, составляла около 0,4 моль л ^-1 . Удельная продуктивность составила 14,6 г янтарной кислоты / г сухой массы клеток в конце ферментации (через 96 ч). Ферментация в B-TF продемонстрировала поведение, подобное анаэробным бутылям на 250 мл. При t = 0 ч; 100% уровень насыщения DO указывает на высокоаэробные условия; однако при t = 48 ч была получена ситуация между аэробными и анаэробными условиями, и наблюдалось небольшое снижение pH (рис. 6b).Производство СК (0,3 моль л ^-1 ) с использованием глюкозы в качестве единственного углеродного субстрата в реакторе было ниже по сравнению со смесью сахаров (данные не показаны). Когда реактор работает в периодическом режиме, важные переменные процесса (например, масса клеток, pH, растворенный кислород (DO), концентрация субстрата) могут значительно различаться [57]. Если уровень растворенного кислорода поддерживается постоянным, эффективность аэрации может использоваться в качестве индикатора биологической активности, а также может быть полезным для контроля процесса.Например, повышенный уровень кислорода неблагоприятен для производства СК, поэтому следует контролировать изменение растворенного кислорода. A. succinogenes может расти в аэробных и анаэробных условиях, изменяя свою физиологию и метаболические пути для адаптации к изменению климата [58,59]. Продукция SA контролируется регуляторными системами, которые определяют уровни кислорода и передают сигнал для соответствующей модификации экспрессии генов [60]. В результате концентрация СК увеличивалась в анаэробных условиях по сравнению с аэробными.Приведенные выше результаты проливают свет на взаимосвязь между режимами культивирования (среда с растворенным кислородом) и производством СК, и в свете этого предположения ферментация A. succinogenes, установленная в микроаэробных условиях, может быть перенесена в анаэробную среду, когда O ₂ полностью расходуется без барботирования азота. Однако накопление СК в бульоне может влиять на образование биомассы, как уже описано в литературе [61]. Известно, что недиссоциированные органические кислоты могут проникать через липидную мембрану бактериальных клеток и диссоциировать при внутриклеточном pH (6.8), снижая внутриклеточный pH. Как следствие, для регулирования внутриклеточного pH потребуется энергия (АТФ), а анаэробные микроорганизмы, такие как A. succinogenes, будут использовать больше энергии для изгнания протонов вместо использования энергии для биосинтеза и роста [62].

3.7.1. Регулирование pH

pH-культура является решающим фактором ферментации. В биореакторе NaOH использовали в качестве буферного агента для производства СК вместе с MgCO ₃ . Хотя использование NaOH может способствовать значительному накоплению ионов Na ⁺ в бульоне в дополнение к NaH ₂ PO ₄ и Na ₂ HPO ₄ , присутствующим в средах, используемых для нейтрализации pH и органических кислот синтез.Известно, что ионы Na ⁺ участвуют во внутриклеточной регуляции pH [31], их накопление приводит к гиперосмотической среде и последующему повреждению морфологии клетки. Эффект может быть настолько серьезным, что он действительно может повлиять на клетки даже на ранней стадии ферментации, снижая темпы роста. Без регулирования pH значение pH в культуре снизилось с 6,8 до 5,7 в конце ферментации из-за накопления янтарной кислоты. По этой причине было важно изучить значение pH для A.производительность производства сукциногенов в настольном реакторе. Влияние pH на накопление СК исследовали, устанавливая pH на уровне 6,8 в течение всего процесса ферментации. Когда pH был доведен до 6,8, не было обнаружено значительного влияния на биосинтез SA в конце ферментации, и нейтральная среда оказалась благоприятной для накопления SA (Таблица 6). Когда pH контролировался, выходы СК и продуктивность были увеличены по сравнению с экспериментами, проводимыми в анаэробных бутылях на 250 мл (0.88 моль C-SA / моль-C сахаров и 0,5 г л ^-1 ч ^-1 ) соответственно, в дополнение к конечной концентрации SA (0,41 моль л ^-1 ). Поддержание pH ферментации в подходящем для микроорганизма диапазоне и выбор подходящего основания для нейтрализации продуцируемой кислоты оказали значительное влияние на общие затраты на производство СК [63]. Таким образом, плотность клеток и потребление сахаров были почти одинаковыми во время ферментации с контролируемым и неконтролируемым pH.

3,7.2. Исследования ферментации в биореакторах разного размера

В этом исследовании методы ферментации сформулированы с использованием бутылок и небольших лабораторных ферментеров. Окружающая среда, окружающая A. succinogenes, может меняться с изменением масштабов производства. Во время лабораторных установок ферментации можно наблюдать количество различных параметров. Параметры, полученные для различных исследованных объемов, и влияние на продукцию СК показаны в Таблице 7. Увеличение масштаба (объема) ферментации без ущерба для выхода или продуктивности было замечено в 250 и 3000 мл.Результаты показывают, что данные были репрезентативными, при увеличении масштаба были получены аналогичные значения концентрации СК и продуктивности по сравнению с таковыми в 3000 мл. Однако при ферментации, произведенной в одном литре, результаты были разными, по этой причине необходимо определить факторы, которые способствуют снижению, и исправить это необходимо. Это могло произойти из-за отсутствия соображений по увеличению масштабов. Предположения, которые необходимо учитывать при разработке процесса производства более высокой ферментации, одинаковы с точки зрения разработки посевного материала, стерилизации, pH, температуры, параметров окружающей среды и перемешивания.Хотя предыдущие исследования, проведенные в анаэробных бутылях, доказали, что снижение плотности клеток и / или биомассы не может быть коррелировано с высокими концентрациями сахара, независимо от природы сахара. Напротив, это может быть связано с накоплением SA в бульоне, как упоминалось в исследовании Lin и соавторов [61]. Когда рост клеток останавливается, поток к пути C ₃ также уменьшается, поскольку больше нет необходимости поддерживать такую ​​потребность в НАДН за счет продукции ацетата и формиата [64]. Таким образом, доступный углерод направляется на производство SA, а затем увеличивается выход SA.Максимальная концентрация СК не связана с общим потреблением сахара, в то время как производство СК начинает замедляться через 52 часа. Можно предположить ингибирующее действие СК на рост бактерий и их продукцию. Из исследованных экспериментов, самая высокая концентрация СК, полученная A. succinogenes, была идентична экспериментам с анаэробными бутылями объемом 250 мл, показав значение 0,28 моль л ^-1 с потреблением сахаров и производительностью СК 1,2 г л ^{— 1} ч ⁻¹ и 0.76 г SA г L ^-1 ч ^-1 через 48 ч соответственно (рис. 5а). Результаты, полученные в этих экспериментах, сравнивались с результатами, представленными в предыдущей работе в Таблице 8 для получения янтарной кислоты из различных субстратов; он похож на другие упомянутые подложки. Производство янтарной кислоты из A. succinogenes CGMCC1593 было зарегистрировано на уровне 0,50 моль л ^-1 , что на 55,5% больше по сравнению с периодической ферментацией 0,32 моль л ^-1 [65]. Mannheimia succiniciproducens LPK7 использовался для производства янтарной кислоты из глюкозы в периодическом цикле с увеличением на 2.В 9 раз концентрация янтарной кислоты по сравнению с периодической ферментацией с подпиткой. Для периодической системы с подпиткой концентрация и производительность янтарной кислоты составляли 0,4 моль л ^-1 , в то время как значения для периодической ферментации составляли 0,1 моль л ^-1 соответственно [66]. Корни маниоки использовали для получения СК с использованием A. Succinogenes, и это привело к концентрации, выходу и продуктивности 0,78 моль л ^-1 , 1,3 и 1,87 г л ^-1 ч ^-1 в периодическом режиме и 1.27 моль л ^-1 , 2,4 и 3,22 г л ^-1 ч ^-1 , в периодическом режиме с подпиткой соответственно [67]. Кукурузная солома была исследована на ферментацию янтарной кислоты с помощью A. succinogenes, зарегистрировав значение SA 0,38 моль л ^-1 , 0,44 моль л ^-1 , что соответствует производительности 0,95 г л ^-1 ч ^-1 , 1,21 г л ^-1 ч ^-1 при периодической ферментации и периодической ферментации с подпиткой, соответственно.

3.8. Влияние СК на рост бактерий

СК можно получить с относительно высокими выходами из сахаров C ₆ , глюкозы и фруктозы с использованием A.сукциногены [43]; тем не менее, максимальная концентрация SA во время ферментации составляла 0,4 моль л ^-1 . До сих пор не проводилось исследований толерантности A. succinogenes к SA. Следовательно, чтобы исследовать этот момент, на рисунке 7 показаны зависимости потребления СК при различных начальных концентрациях СК (SA ₀ ). Можно ясно видеть, что потребление СК оставалось постоянным в ходе культивирования. Цель состояла в том, чтобы получить более подробную информацию об ингибирующих формах субстрата / продукта, а также о концентрациях, вызывающих ингибирование.Ингибирование продукта проверяли в периодических тестах и ​​на чашке Петри с использованием среды TSA. Каждый эксперимент проводился с использованием набора из шести чашек Петри. Один из них служил отрицательным контролем, в то время как пять других содержали повышенные концентрации янтарной кислоты в диапазоне от 0,1 до 0,5 моль л ^-1 . Через 24 ч инкубации штамм развивался на TSA, содержащем 0, 0,1, 0,2 и 0,3 моль л ^-1 SA, в то время как развития не наблюдалось на TSA, содержащем 0,4 и 0,5 моль л ^-1 SA (рис. 8).Результаты показали, что начальная критическая концентрация СК для биологической активности A. succinogenes составляла около 0,4 моль л ^-1 , и при этом SA ₀ роста бактерий не наблюдалось. Фактически, сукцинат оказывает важное ингибирующее действие на рост клеток, а также на продукцию СК; насколько нам известно, об этом наблюдении широко не сообщалось. Рост клеток подходил для обнаружения ингибирования, вызванного продуцированием СК [72]. Результаты тестов на ингибирование, проведенных на разных чашках Петри, показали отрицательный рост, начиная с 0.4 моль л ⁻¹ концентрации СК. Это значение довольно хорошо коррелирует с полученным Lin et al., [61], который проверил влияние различных концентраций субстрата и продукта на рост A. succinogenes и вычислил критическую концентрацию SA для бактерий, перестающих расти на 0,38 моль. L ^-1 SA и дополнительно подтверждают концепцию ингибирования роста A. succinogenes продуктом при периодической ферментации. Хотя наши результаты в некоторой степени отличаются от результатов [73], который количественно оценил ингибирующие явления и критическую ингибирующую концентрацию смешанных кислот при периодической ферментации, которая наблюдалась при 0.18 моль л ⁻¹ для СК с использованием A. succinogenes. Несмотря на то, что это значение отличается от полученных нами результатов и предыдущих исследований, они согласуются с концепцией, согласно которой накопление продуктов ферментации, таких как слабые кислоты, может действовать как тормозящие факторы и значительно снижать рост клеток [74,75].

Показано соединение янтарной кислоты (FDB001931)

Запись информации
Версия	1.0
Дата создания	2010-04-08 22:05:10 UTC
Дата обновления -09-17 15:42:08 UTC
Первичный идентификатор	FDB001931
Вторичные регистрационные номера
Химическая информация
		Описание	Янтарная кислота представляет собой ациклическую дикарбоновую кислоту с четырьмя атомами углерода.Это белое твердое вещество без запаха с очень кислым вкусом. Он используется в качестве ароматизатора, вносящего кислый и вяжущий компонент, характерный для вкуса умами (PMID: 21932253). Анион, сукцинат, является ключевым компонентом цикла лимонной кислоты или TCA и способен отдавать электроны цепи переноса электронов. Сукцинатдегидрогеназа (SDH) играет важную роль в функции митохондрий, будучи одновременно частью дыхательной цепи и цикла Кребса. SDH с ковалентно присоединенной простетической группой FAD способен связывать несколько различных субстратов ферментов (сукцинат и фумарат) и физиологические регуляторы (оксалоацетат и АТФ).Окисляющий сукцинат связывает SDH с частью цикла Кребса с быстрым циклом, где он участвует в расщеплении ацетил-КоА на протяжении всего цикла Кребса. Было обнаружено, что янтарная кислота связана с D-2-гидроксиглутаровой ацидурией, которая является врожденной ошибкой метаболизма. Янтарная кислота также является микробным метаболитом. Действительно, янтарная кислота в моче продуцируется Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumonia, Enterobacter sp., Acinetobacter sp., Proteus mirabilis, Citrobactes frundii, Enterococcus faecalis (PMID: 222 ).Янтарная кислота также содержится в Actinobacillus, Anaerobiospirillum, Mannheimia, Corynebacterium и Basfia (PMID: 222 ; PMID: 181; PMID: 26360870). Янтарная кислота или ее анион-сукцинат используется в качестве наполнителя в фармацевтических продуктах для контроля кислотности или в качестве противоиона. Лекарства, содержащие сукцинат, включают сукцинат метопролола, сукцинат суматриптана, сукцинат доксиламина или сукцинат солифенацина. В 2004 году янтарная кислота была определена Министерством энергетики Соединенных Штатов Америки как одна из двенадцати молекул, которые могут быть произведены из растительных сахаров с помощью биологических или химических процессов и которые могут впоследствии преобразоваться в ряд высокоактивных веществ. ценить химические вещества или материалы на биологической основе.
Номер CAS	110-15-6
Структура
Синонимы	биоспайдер2EDIOIC янтарная кислота) Eource88 Eource88 9128 -1,2-дикарбоновая кислота 9128 9128 этилен-янтарная кислота Этилен-янтарная кислота88 биоспайдер Катасукцин биоспайдер биоспайдер8 биоспайдер биоспайдер биоспайдер полынь биоспайдер полынь 9128 9128 9128 9128 9128 9128 9128 Свойства — экспериментальные GC Spectra MS 9128 9128 9128 9128 9128L ChemSpider ID 9128 9128EML Лекарство 9128 9128 9128 9128 912 ID 9128 Metabolite ID Синоним 1,2-этандикарбоновая кислота биоспайдер 1,4-бутандиоат биоспайдер 1,4-бутандиовая кислота биоспайдер 88 biospider 1cze biospider кислота янтарная biospider Acide butanedioique ChEBI Acide succinique ChEBI фолиевую succinicum биоспайдер Янтарная кислота db_source 91 289 Янтарная кислота, бутандиова кислота, ethylenesuccinic кислота biospider аммония сукцинат biospider Asuccin biospider Bernsteinsaeure ChEBI Butandisaeure ChEBI Бутандиовая кислота биоспайдер Бутандиовая кислота (9CI) биоспайдер Бутандиовая кислота диаммониевая соль биоспайдер Бутандионовая кислота биоспайдер Дигидрофумарат биоспайдер Дигидрофумаровая кислота биоспайдер db_source Этандикарбоновая кислота биоспайдер Этилендикарбоновая кислота биоспайдер Этилен янтарная кислота биоспайдер FMR биоспайдер HOOC-Ch3-Ch3-COOH биоспайдер биоспайдер Sal succini биоспайдер Соль янтаря биоспайдер SIN биоспайдер биоспайдер биоспайдер SUCC биоспайдер Сукцинат биоспайдер сукцинат, 9 биоспайдер Янтарная кислота, acs биоспайдер Succinicum acidum биоспайдер Succinicun acidum биоспайдер Прогнозируемые свойства Недоступно Химическая формула C4H6O4 Название IUPAC Идентификатор InChI InChI (1ShI / chI6) 1-2-4-3 (6) ChI (6) 7) 8 / х2-2х3, (Н, 5,6) (Н, 7,8) Ключ InChI KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Изомерные SMILES OC (= O) CCC (O) = O Средний молекулярный вес 118 088 Моноизотопная молекулярная масса 118.02660868 Классификация Классификация Не классифицируется Онтология Путь воздействия: Источник: Биологическое местоположение: Роль Биологическая роль: Промышленное применение: Физико-химические свойства — Экспериментальные Физические Данные Нет данных Свойство Значение Ссылка Физическое состояние Твердый Физическое описание Недоступно Массовый состав C 40.68%; H 5,12%; O 54,19% DFC Точка плавления Т.пл. 184-185 ° DFC Точка кипения Bp 235 ° дек. DFC Экспериментальная растворимость в воде 83,2 мг / мл при 25 oC YALKOWSKY, SH & HE, Y (2003) Экспериментальный журнал P -0,59 ET ALSCH, CAN 9. (1995) Экспериментальная pKa pKa2 5.7 (25 °, h3O) DFC Изоэлектрическая точка Недоступно Заряд Недоступно Оптическое вращение Недоступно Плотность Недоступно Показатель преломления Недоступно Spectra Недоступно MS / MS Недоступно ЯМР Недоступно Внешние ссылки ChemSpider ID Идентификатор соединения КЕГГ C000 42 Идентификатор соединения Pubchem 1110 Идентификатор вещества Pubchem Недоступно Идентификатор ChEBI 15741 DB00139 HMDB ID HMDB00254 CRC / DFC (Словарь пищевых соединений) ID CBG32-P: CBG32-P EAFUS IDDuke ID СУКЦИНОВАЯ КИСЛОТА BIGG ID 33633 KNApSAcK ID C00001205 HET ID Недоступно Flavornet ID Недоступно GoodScent ID rw1040431 SuperScent ID 1110 8 9128 9128 9128 Недоступно Дубликат IDS Недоступно Старое IDS DFC Недоступно Ассоциированные продукты См. ence Продукты питания Ссылка
Биологические эффекты и взаимодействия
Воздействие на здоровье / биоактивность
добавка	64047	Любое вещество, которое добавляется в пищу для сохранения или улучшения ее вкуса и / или внешнего вида.	DUKE
антикорм			DUKE
bruchiphobe			DUKE
противоопухолевый препарат, предотвращающий распространение рака							препятствует пролиферации.	DUKE
краситель	37958		DUKE
парфюмерия	48318	Вещество, экстракт или препарат для распространения или придания приятного или привлекательного запаха.	DUKE
пестицид	25944	Строго говоря, вещество, предназначенное для уничтожения вредителей. Обычно используется любое вещество, используемое для борьбы, предотвращения или уничтожения животных, микробиологических или растительных вредителей.	DUKE
противоязвенное средство	49201	Один из различных классов препаратов с разными механизмами действия, используемых для лечения или облегчения язвенной болезни или раздражения желудочно-кишечного тракта.	CHEBI

Ферменты Недоступно Пути Недоступно Организм Недоступно 9128 9128 9128 9128 9128 9128 9128 9128 9128 9128 9128 Ароматизаторы Файлы MSDS показывают Ссылки Синтез Ссылка Недоступно 9128 Общее содержание 9128 — Герцог, Джеймс.Доктор Фитохимические и этноботанические базы данных Герцога. Министерство сельского хозяйства США ». Служба сельскохозяйственных исследований, по состоянию на 27 апреля (2004 г.).
— Шинбо Ю. и др. «KNApSAcK: обширная база данных о взаимоотношениях между видами и метаболитами». Метаболомика растений. Springer Berlin Heidelberg, 2006. 165–181.

янтарная кислота, 110-15-6

	люцерна Search Trop Picture
	яблони Search Trop Picture
	абрикос Search Trop Picture
	побеги спаржи Search Trop Picture
	банановые фрукты Search Trop Picture
	банановый лист Search Trop Picture
	базилик Search Trop Picture
	фасоль черная фасоль фрукты Search Trop Picture
	бобовое поле бобовый плод Search Trop Picture
	пиво Поиск PMC Изображение
	лист черники Search Trop Picture
	брокколи спаржа брокколи Search Trop Picture
	лист брюссельской капусты Search Trop Picture
	Облепиха Плоды облепихи Search Trop Picture
	капустный лист Search Trop Picture
	корень моркови Search Trop Picture
	корень сельдерея Search Trop Picture
	сыр швейцарский сыр @ 4.00 & plusmn; 1 ммоль Данные GC Искать изображение
	вишня кислая вишня Search Trop Picture
	лист чеснока Search Trop Picture
	корень кокоса Search Trop Picture
	семена кокоса Search Trop Picture
	кукуруза Search Trop Picture
	семена кукурузы Search Trop Picture
	смородина красная смородина плоды Search Trop Picture
	инжир Search Trop Изображение
	фруктовый сок инжира Search Trop Picture
	чеснок Search Trop Picture
	лист гинкго билоба Search Trop Picture
	пыльца гинкго билоба Search Trop Picture
	виноград Search Trop Picture
	растение киви Search Trop Picture
	мелисса Search Trop Picture
	лайм Search Trop Изображение
	мушмула Search Trop Picture
	люпин белый семена люпина Search Trop Picture
	плоды манго Search Trop Picture
	луковица Search Trop Picture
	лист лука Search Trop Picture
	апельсин Search Trop Picture
	апельсиновый сок Search Trop Picture
	растение петрушки Search Trop Picture
	корень петрушки Search Trop Picture
	семена гороха Search Trop Picture
	фисташки Search Trop Picture
	плоды сливы Search Trop Picture
	плод граната Search Trop Picture
	мак опийный мак латекс Search Trop Picture
	растение картофеля Search Trop Picture
	малина красная малина Search Trop Picture
	малина красная малина плоды, листья Search Trop Picture
	малиновый красный лист малины Search Trop Picture
	ревень Search Trop Picture
	корень сои Search Trop Picture
	семена сои Search Trop Picture
	ростки сои Search Trop Picture
	карамболы Search Trop Picture
	лист подсолнечника Search Trop Picture
	Фрукты тамаринда Search Trop Picture
	семена тамаринда Search Trop Picture
	фрукты томатилло Search Trop Picture
	помидор фрукты Search Trop Picture

.