Янтарная кислота для чего ее применяют: показания и противопоказания, состав и дозировка – АптекаМос

Янтарная кислота: польза и вред порошка из «солнечного камня»

https://ria.ru/20210215/yantarnaya_kislota-1597597811.html

Янтарная кислота: польза и вред порошка из «солнечного камня»

Янтарная кислота: польза и вред порошка из «солнечного камня» — РИА Новости, 15.02.2021

Янтарная кислота: польза и вред порошка из «солнечного камня»

Янтарная кислота — соединение, которое играет важную роль в метаболизме. О свойствах вещества — в материале РИА Новости. РИА Новости, 15.02.2021

2021-02-15T19:51

2021-02-15T19:51

2021-02-15T19:51

здоровый образ жизни (зож)

косметология

витамины

здоровье — общество

питание

общество

/html/head/meta[@name=’og:title’]/@content

/html/head/meta[@name=’og:description’]/@content

https://cdn22.img.ria.ru/images/07e5/02/0f/1597585655_0:121:2272:1399_1920x0_80_0_0_86ae36df6150f43164767115ab7d1a61.jpg

МОСКВА, 15 фев — РИА Новости. Янтарная кислота — соединение, которое играет важную роль в метаболизме. О свойствах вещества — в материале РИА Новости.Применение янтарной кислотыБутандиовая или этан-1,2-дикарбоновая кислота — она же янтарная — это продукт, полученный в процессе переработки природного янтаря. Продукт из «солнечного камня» выглядит как белый кристаллический порошок и походит по вкусу на лимонную кислоту. Из него делают лекарственные препараты и БАДы в форме таблеток, капсул, раствора для инъекций или расфасовывают по саше. Вещество добавляют в косметические маски, скрабы, зубные порошки, настойки для ингаляций. Янтарную кислоту применяют в качестве биологической добавки в питании животных и для подкормки растений.Применение янтарной кислоты в медицинеТакже довольно эффективно используется янтарная кислота для похудения, так как помогает ускорить процессы, способствующие расщеплению жира.Кроме того, соли янтарной кислоты положительно влияют на работу головного мозга, что может значительно отсрочить появление признаков старения. Именно поэтому вещество назначают при появлении первых признаков развития патологических процессов мозга у пожилых людей.Действие янтарной кислотыКак отмечает специалист, янтарная кислота — это важнейший элемент в образовании веществ, которые участвуют в строительстве и обновлении клеток и тканей. Она противостоит делению злокачественных клеток, снижает выработку гистамина, регулирует энергетический обмен, нормализует функции органов и тканей, восстанавливая в них протекание биохимических реакций.Эта кислота защищает клетки организма от негативного воздействия окружающей среды, оказывает антитоксическое, противовирусное и антигипоксическое воздействие на организм в целом.Янтарная кислота как регулятор состояния организмаОрганизм человека вырабатывает янтарную кислоту, которая участвует в процессах метаболизма и клеточного дыхания. Потребность в ней растет при повышенных физических, психоэмоциональных, интеллектуальных нагрузках, болезнях. Янтарная кислота способна скапливаться именно в тех тканях, которые в ней нуждаются, игнорируя здоровые органы.Если наблюдается дефицит, то запас вещества можно пополнить с помощью биологически активных добавок и препаратов, например, таблеток янтарной кислоты.Янтарная кислота: показания и противопоказанияЧаще всего препараты на основе янтарной кислоты назначают при лечении:Соединение не является допингом, не приводит к истощению внутренних сил организма. Оно не вызывает привыкания и относится к веществам 5 класса опасности, то есть практически не токсично и не обладает мутагенным действием.Поскольку янтарная кислота — вещество, вырабатываемое в организме человека, при ее приеме очень редко возникает аллергическая реакция. Однако существуют и противопоказания к применению:Совместимость янтарной кислоты с другими препаратами доказана. Вещество рекомендуют принимать со многими лекарствами, так как оно снижает их токсический эффект. При этом кислота снижает действие барбитуратов и анксиолитиков, потому лучше принимать ее отдельно от микронутриентов.Пероральное использованиеЧаще всего ответ на вопрос, как принимать янтарную кислоту, содержится в упаковке приобретенной добавки. В соответствии с инструкцией янтарную кислоту следует употреблять до еды, предварительно растворив в фруктовом или ягодном соке или минеральной воде.Косметологическое использованиеОдно из важных мест среди всего, для чего полезна янтарная кислота, занимает красота. Это связано с ее свойствами замедлять процессы старения, снимать воспаления и бороться с пигментацией. Косметика на основе янтаря была известна еще во времена Древнего Египта и востребована до сих пор.Янтарная кислота для лицаИспользование янтарной кислоты для женщин является отличным способом повысить эластичность кожи, выровнять ее тон, сделать темные круги под глазами менее заметными и обновить верхние слои наружных покровов.Для кожи лица вещество можно использовать как самостоятельно, так и в качестве обогащающего компонента различных готовых косметических средств.В первом случае необходимо растолочь две таблетки весом 1 грамм и добавить к получившемуся порошку 1 столовую ложку воды. Когда смесь растворится, ее можно наносить на лицо. Маску стоит оставлять на коже до полного впитывания, не смывая. Повторять процедуру разрешается 1-2 раза в неделю.Во втором случае можно добавлять по две растолченные таблетки весом 1 грамм на каждые 100 мл косметического средства (маски, крема, тоника и других), а после использовать его обычным способом. Применение янтарной кислоты для рукВещество из янтаря благотворно воздействует на кожу рук и ногтевую пластину. Чтобы сделать полезную маску-скраб из янтарной кислоты, необходимо смешать измельченную таблетку препарата и чайную ложку меда. С получившимся составом нужно сделать массаж рук, а затем смыть его теплой водой.А для здоровья ногтей можно приготовить специальную ванночку. Для этого нужно развести пару таблеток янтарной кислоты в небольшом количестве воды, дать настояться, а после долить горячей жидкости, чтобы можно было окунуть в состав руки. После 10 минут в такой ванночке кожа станет нежнее, а ногтевая пластина посветлеет.

https://ria.ru/20210120/svetlyachki-1593715505.html

https://radiosputnik.ria.ru/20210113/1592839532.html

https://radiosputnik.ria.ru/20210122/mozg-1594148476.html

https://radiosputnik.ria.ru/20201228/kosmetolog-1591213279.html

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

2021

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

Новости

ru-RU

https://ria.ru/docs/about/copyright.html

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

https://cdn21.img.ria.ru/images/07e5/02/0f/1597585655_123:0:2150:1520_1920x0_80_0_0_95be3a9de371ad3f69350f808aaa6f52.jpg

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

РИА Новости

[email protected]

7 495 645-6601

ФГУП МИА «Россия сегодня»

https://xn--c1acbl2abdlkab1og.xn--p1ai/awards/

здоровый образ жизни (зож), косметология, витамины, здоровье — общество, питание, общество

МОСКВА, 15 фев — РИА Новости. Янтарная кислота — соединение, которое играет важную роль в метаболизме. О свойствах вещества — в материале РИА Новости.

Применение янтарной кислоты

Бутандиовая или этан-1,2-дикарбоновая кислота — она же янтарная — это продукт, полученный в процессе переработки природного янтаря. Продукт из «солнечного камня» выглядит как белый кристаллический порошок и походит по вкусу на лимонную кислоту. Из него делают лекарственные препараты и БАДы в форме таблеток, капсул, раствора для инъекций или расфасовывают по саше. Вещество добавляют в косметические маски, скрабы, зубные порошки, настойки для ингаляций. Янтарную кислоту применяют в качестве биологической добавки в питании животных и для подкормки растений.

Применение янтарной кислоты в медицине

— Это вещество используют при гипоксии, варикозе, сердечной недостаточности, для укрепления иммунитета, нормализации работы поджелудочной железы, профилактики возрастной деменции и когнитивных расстройств, повышения стрессоустойчивости и при повышенных умственных и физических нагрузках. Кроме того, она помогает справиться с интоксикацией, в том числе алкогольной, и снижает уровень сахара в крови, — рассказала нутрициолог Елена Селезнева.

Также довольно эффективно используется янтарная кислота для похудения, так как помогает ускорить процессы, способствующие расщеплению жира.

Кроме того, соли янтарной кислоты положительно влияют на работу головного мозга, что может значительно отсрочить появление признаков старения. Именно поэтому вещество назначают при появлении первых признаков развития патологических процессов мозга у пожилых людей.

20 января, 03:00НаукаВ янтаре нашли самое древнее светящееся существо

Действие янтарной кислоты

Как отмечает специалист, янтарная кислота — это важнейший элемент в образовании веществ, которые участвуют в строительстве и обновлении клеток и тканей. Она противостоит делению злокачественных клеток, снижает выработку гистамина, регулирует энергетический обмен, нормализует функции органов и тканей, восстанавливая в них протекание биохимических реакций.

Эта кислота защищает клетки организма от негативного воздействия окружающей среды, оказывает антитоксическое, противовирусное и антигипоксическое воздействие на организм в целом.

Янтарная кислота как регулятор состояния организма

Организм человека вырабатывает янтарную кислоту, которая участвует в процессах метаболизма и клеточного дыхания. Потребность в ней растет при повышенных физических, психоэмоциональных, интеллектуальных нагрузках, болезнях. Янтарная кислота способна скапливаться именно в тех тканях, которые в ней нуждаются, игнорируя здоровые органы.

13 января, 11:47ИнтервьюСолнечный камень. Что нам может рассказать янтарь?

Если наблюдается дефицит, то запас вещества можно пополнить с помощью биологически активных добавок и препаратов, например, таблеток янтарной кислоты.

— Симптомы, сигнализирующие о нехватке этого вещества: ранние возрастные изменения, нехватка сил, повышенная утомляемость, сниженный иммунитет, эмоциональный упадок, депрессия, метеочувствительность, нарушения памяти и способности сосредоточиться, — отметила эксперт.

Янтарная кислота: показания и противопоказания

Чаще всего препараты на основе янтарной кислоты назначают при лечении:

• —

  болезней щитовидной железы;

• —

  гингивита и пародонтоза;

• —

  ОРЗ;

• —

  сердечно-сосудистых заболеваний;

• —

  отравлений, в том числе похмельного синдрома;

• —

  анемии и других недугах.

Соединение не является допингом, не приводит к истощению внутренних сил организма. Оно не вызывает привыкания и относится к веществам 5 класса опасности, то есть практически не токсично и не обладает мутагенным действием.

22 января, 13:32

Хитрый иммунитет. Ученым удалось раскрыть секрет старения мозга

Поскольку янтарная кислота — вещество, вырабатываемое в организме человека, при ее приеме очень редко возникает аллергическая реакция. Однако существуют и противопоказания к применению:

• —

  артериальная гипертензия;

• —

  ишемическая болезнь сердца;

• —

  язва желудка или кишечника;

• —

  стенокардия;

• —

  глаукома;

• —

  поздний гестоз беременных.

Совместимость янтарной кислоты с другими препаратами доказана. Вещество рекомендуют принимать со многими лекарствами, так как оно снижает их токсический эффект. При этом кислота снижает действие барбитуратов и анксиолитиков, потому лучше принимать ее отдельно от микронутриентов.

Пероральное использование

Чаще всего ответ на вопрос, как принимать янтарную кислоту, содержится в упаковке приобретенной добавки. В соответствии с инструкцией янтарную кислоту следует употреблять до еды, предварительно растворив в фруктовом или ягодном соке или минеральной воде.

— Для профилактики заболеваний и улучшения общего самочувствия взрослым рекомендуется принимать 100-300 миллиграмм в день в течение месяца. Применение янтарной кислоты в больших суточных дозах может назначить только врач по показаниям. Также, для предупреждения развития алкогольной интоксикации 200 миллиграмм вещества принимают за час до приема алкоголя. Для снятия алкогольной интоксикации — по 200 миллиграмм 3-4 раза в сутки, — отметила Елена Селезнева.

Косметологическое использование

Одно из важных мест среди всего, для чего полезна янтарная кислота, занимает красота. Это связано с ее свойствами замедлять процессы старения, снимать воспаления и бороться с пигментацией. Косметика на основе янтаря была известна еще во времена Древнего Египта и востребована до сих пор.

Янтарная кислота для лица

Использование янтарной кислоты для женщин является отличным способом повысить эластичность кожи, выровнять ее тон, сделать темные круги под глазами менее заметными и обновить верхние слои наружных покровов.

Для кожи лица вещество можно использовать как самостоятельно, так и в качестве обогащающего компонента различных готовых косметических средств.

В первом случае необходимо растолочь две таблетки весом 1 грамм и добавить к получившемуся порошку 1 столовую ложку воды. Когда смесь растворится, ее можно наносить на лицо. Маску стоит оставлять на коже до полного впитывания, не смывая. Повторять процедуру разрешается 1-2 раза в неделю.

Во втором случае можно добавлять по две растолченные таблетки весом 1 грамм на каждые 100 мл косметического средства (маски, крема, тоника и других), а после использовать его обычным способом.

Применение янтарной кислоты для рук

Вещество из янтаря благотворно воздействует на кожу рук и ногтевую пластину.
Чтобы сделать полезную маску-скраб из янтарной кислоты, необходимо смешать измельченную таблетку препарата и чайную ложку меда. С получившимся составом нужно сделать массаж рук, а затем смыть его теплой водой.

А для здоровья ногтей можно приготовить специальную ванночку. Для этого нужно развести пару таблеток янтарной кислоты в небольшом количестве воды, дать настояться, а после долить горячей жидкости, чтобы можно было окунуть в состав руки. После 10 минут в такой ванночке кожа станет нежнее, а ногтевая пластина посветлеет.

28 декабря 2020, 13:22

«Эффект выраженный». Косметолог дала совет, как «скинуть» пару лет

Янтарная кислота для лица: бюджетное омоложение

Янтарная кислота для лица – инновационное средство, популярность которого постоянно растет. Востребованность продукта связана с возможностью его широкого применения, как наружно, так и перорально. Соли и эфиры препаратов на основе янтарной кислоты обладают хорошей проникающей способностью и высокой усвояемостью.

На странице Пластично.ком мы нашли много интересного о пользу янтарной кислоты и методах ее применения.

Янтарная кислота для лица – свойства

Популярность в косметологии янтарной кислоты обусловлена ее полезностью и широким спектром действия. Изучение этого вещества учеными подтверждает ее эффективность в отношении регенерации тканей, и избирательное воздействие препарата только на поврежденные клетки.

К полезным качествам этого вещества относятся:

• способность разглаживать небольшие морщинки;
• устранение неглубоких шрамов;
• устранение отечности на лице;
• снятие воспаления;
• улучшение капиллярного кровотока;
• очищение пор;
• уменьшение размера пор;
• замедление возрастных изменений в коже;
• стимуляция выработки коллагена.

Регулярное, одобренное врачом, применение янтарной кислоты позволит не только улучшить состояние кожи лица, но и продлить молодость.

Показания и противопоказания

Улучшение внешности, омоложение лица и устранение имеющихся проблем – существенные плюсы от применения янтарной кислоты в качестве косметологического препарата. Сукцинаты этого лекарственного средства – достаточно сложные вещества, которые при попадании внутрь могут приносить не только пользу, но и вред.

В числе показаний к наружному применению:

1. Возрастные изменения.
2. Тусклый цвет лица.
3. Появление мелких морщин.
4. Повышенная пигментация и т.д.

К противопоказаниям для наружного использования относятся такие состояния:

• аллергия;
• воспалительные процессы;
• беременность;
• присутствие незаживших повреждений кожного покрова.

Перечень противопоказаний для приема таблеток внутрь – значительно шире. Он включает кардиологические патологии, глаукому и некоторые другие заболевания.

До сих пор ведутся работы по изучению действия такого неоднозначного вещества на внутренние органы. Есть предположения о возможной связи между приемом таблеток с ним и образованием камней в желчном пузыре и почках.

Пероральное использование

Несмотря на все достоинства, янтарная кислота не является безобидным средством, которое можно пить без контроля. Это вещество имеет свои особенности применения, поэтому предварительная консультация специалиста – обязательна.

Стандартная схема приема:

• 1-3 день приема. 500 мг утром, после еды.
• На 4-5 день не принимают.
• 6-8 день – 250 мл утром, после еды.
• 9-10 день также не принимают.

Для того чтобы янтарная кислота попадала в организм, не обязательно принимать ее в виде таблеток – достаточно грамотно составить рацион. Это нужное человеку вещество содержится в таких продуктах:

• яблоки;
• кефир;
• медопродукты;
• вишня;
• пивные дрожжи и т.д.

Выпускаются лекарственные препараты, в составе которых присутствует янтарная кислота. Например, «Янтарит», «Ремаксол» и другие.

Косметологическое использование

Янтарная кислота входит в состав большого количества готовых косметических препаратов. Кроме того, этот ингредиент можно вводить в состав домашних средств для поддержания красоты и молодости, для этого покупаются в аптеке таблетки.

Маска-пилинг

Такая маска позволит качественно очистить кожу, стянуть поры, убрать прыщи и покраснения. Для ее приготовления понадобится:

• вода;
• препарат в таблетках.

Порядок действий:

1. Раздавить 3 таблетки в порошок.
2. Добавить немного воды, чтобы образовалась кашица.
3. Нанести на очищенное лицо.
4. Оставить на четверть часа.
5. Смыть водой.
6. Нанести питательный крем.

Так как маска обладает свойствами пилинга, то ее применение должно быть не чаще 1 раза в неделю.

Маска питательная

Для приготовления питательного состава понадобятся такие компоненты:

• оливковое масло;
• янтарная кислота.

Приготовление:

1. Растолочь в порошок 2 таблетки.
2. Соединить в емкости порошок и 2 ст. л. масла.
3. Перемешать.
4. Нанести на лицо.
5. Оставить на 15-20 минут.
6. Снять салфеткой.

Маска отбеливающая

Для приготовления состава понадобится:

• голубая глина;
• молоко;
• таблетки.

Порядок действий:

1. В емкость всыпать 3 растолченные таблетки.
2. Всыпать 3 ст. л. глины.
3. Добавить столько молока, чтобы образовалась кашица.
4. Нанести на кожу.
5. Оставить на полчаса.
6. Смыть.

Тоник

Для приготовления тоника понадобится основной продукт и вода. В ¼ стакана воды опускают 2 таблетки кислоты и размешивают. Готовый раствор используется для протирания кожи спонжем.

Антивозрастной скраб

Для приготовления очищающего состава понадобятся такие компоненты:

• мед;
• кофе молотый;
• аптечные таблетки.

Приготовление и применение:

1. Растопить в огнеупорной емкости мед.
2. Добавить 1 ст. л. перемолотого кофе.
3. Размешать.
4. Добавить раздавленные в порошок 3 таблетки.
5. Перемешать.
6. Нанести на кожу круговыми движениями.
7. Смыть теплой водой.

Количество обработок зависит от типа кожи. Для жирной – еженедельно, для сухой – раз в 2 недели.

Отзывы косметологов

Косметологи относятся к наружному применению янтарной кислоты преимущественно положительно. При правильном использовании в соответствии с выверенными рецептами, этот препарат приносит только пользу, стимулируя процессы обновления. Если нет индивидуальной негативной реакции на вещество, его возможно применять регулярно в составе масок, скрабов и тоников.

Отзывы клиентов

«Домашняя косметология позволяет мне экономить деньги и время. Сделать маску самостоятельно для меня намного проще, чем обращаться в косметологический салон. Про янтарную кислоту я узнала от коллеги. Запомнилось интересное красивое название. После изучения вопроса в интернете, взялась за составление пилингов. Эффект – отличный, даже не ожидала такого от простого домашнего рецепта.» Алина, 33 года

«Из-за специфики своей чувствительной кожи, к пилингам отношусь с большим вниманием, тщательно выбираю рецепты. Янтарная кислота оправдала все мои ожидания – это результативное и легко доступное средство.» Оксана, 29 лет

Использование янтарной кислоты для борьбы с морщинами, от пигментных пятен может стать настоящей находкой домашней косметологии. Использование этого вещества позволяет достичь хорошего эффекта без неприятных побочных эффектов.

Материалы взяты с Plastichno.com

Янтарная кислота: инструкция, применение, цена

Янтарная кислота – диетическая добавка к рациону питания, которая может быть рекомендована в качестве дополнительного источника янтарной и аскорбиновой кислот.

Действующее вещество – янтарная кислота.
Дополнительные вещества: крахмал, лактоза, стеарат кальция, аскорбиновая кислота или витамин С – 0,01.
Состав на одну таблетку: янтарная кислота – 150 мг, аскорбиновая кислота – 20 мг, вспомогательные вещества.
Состав на одну капсулу: МКЦ – 204. 0 мг, янтарная кислота – 160,0 мг, аскорбиновая кислота – 20,0 мг, кальция стеарат – 12,0 мг, аэросил – 4,0 мг.

Выпускается препарат в двух формах: таблетках и капсулах. Обычно таблетки белого цвета, выпуклые.

Янтарную кислоту преимущественно применяют в виде биологических добавок для комплексного лечения. Это замечательный абсорбент и антиоксидант.

Назначают ее для различных нужд:

• для стимулирования энергетического обмена клеток;
• для улучшения мозгового кровообращения и работы сердца;
• для профилактики возникновения склеротических проявлений;
• для содействия вывода токсинов из организма;
• для лечения острых респираторных заболеваний и гриппа;
• для улучшения иммунитета;
• для общего улучшения дееспособности организма;
• для снятия болевых ощущений и спазмов;
• для ускорения вывода алкоголя с организма и уменьшения его токсического действия;
• для регулирования свертываемости крови, нормализации проникновения капилляров
• обладает противоаллергическим действием.

Кислоту нельзя употреблять пациентам с особой чувствительностью и реакцией на компоненты состава. Также не назначают больным с наличием артериальной гипертензии, ишемической болезни сердца, желудочно язвы, глаукомой. Детям и беременным женщинам на 2 и 3 триместрах препарат принимать нельзя.

Запрещено применять беременным женщинам и детям.

Нельзя употреблять янтарную кислоту в смежности с анксиолитиками и барбитуратами, ведь сукцинат, содержащийся в них, уменьшает терапевтическое действие кислоты.

Янтарная кислота хорошо снижает токсическое действие антибиотиков, поэтому часто её прописывают для комплексного лечения болезней.

Применение во время беременности и кормления грудью

Препарат можно принимать только женщинам на первом триместре в указанных врачом дозах. При кормлении грудью принимать янтарную кислоту разрешено.

Способность влиять на скорость реакции

Не влияет на способность управлять автомобилем или другими движущимися механизмами.

Янтарную кислоту принимают во внутрь перед приемом пищи.

• Для предупреждения развития алкогольной интоксикации препарат принимaют по 250 мг за час до приемa алкоголя.
• При лечении алкогольнoго абстинентного синдромa янтарную кислоту назначают по 250 мг от 3 до 4 раз в сутки от 4 до 10 дней.
• Для стимуляции аппетита препарат принимают по 250 мг oт 1 до 3 рaза в сутки на прoтяжении 3 или 5 дней.

В других случаях дозировку назначает врач.

Случаев передозировки не зафиксировано. Однако, вероятно, передозировка характеризуется обострением побочных симптомов.

Побочные эффекты

Поскольку янтарная кислота – это естественный препарат, побочные эффекты возникают крайне редко. Однако могут наблюдаться эпигастральные боли, гиперсекреция желудочного сока и повышение артериального давления. Не вызывает зависимости.

Срок годности – 4 года.

Условия и срок хранения

Следует хранить в оригинальной упаковке в защищенном от солнца и влаги месте, недоступном для детей.

Выпускается без рецепта.

Цена препарата в аптеках разнится между 17 и 30 гривнами в зависимости от количества действующего вещества.

Янтарная кислота и ее применение в медицине. Часть II. Применение янтарной кислоты в медицине Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

© А.В.Смирнов, О.Б.Нестерова, Р.В.Голубев, 2014 УДК 612.8.015

А.В. Смирнов1, О.Б. Нестерова1, Р.В. Голубев1

ЯНТАРНАЯ КИСЛОТА И ЕЕ ПРИМЕНЕНИЕ В МЕДИЦИНЕ. Часть II. Применение янтарной кислоты в медицине

A.V. Smirnov, O.B. Nesterova, R.V. Golubev

SUCCINIC ACID AND ITS APPLICATION IN MEDICINE. Part II. Application of succinic acid in medicine

1 Кафедра и клиника пропедевтики внутренних болезней Первого Санкт-Петербургского государственного медицинского университета им. акад. И.П. Павлова, Россия

РЕФЕРАТ

В обзоре представлены данные о применении препаратов янтарной кислоты в различных областях современной медицины.

Ключевые слова: янтарная кислота, сукцинатсодержащие препараты. ABSTRACT

The review presents data on the use of succinate-containing drugs in various fields of modern medicine Key words: succinic acid, succinate-containing drugs

Применение препаратов янтарной кислоты в кардиологии

История применения янтарной кислоты (ЯК) в качестве лекарственного препарата насчитывает уже несколько десятилетий. В СССР использовать препараты ЯК в клинической практике начали с 1972 г., когда было получено временное разрешение Фармакологического комитета Минздрава СССР на лечебное применение ЯК [1]. В настоящее время препараты, содержащие сукцинат, существуют и применяются как в пероральной, так и в парентеральной формах (таблица).

Области применения препаратов ЯК весьма разнообразны и включают кардиологию, неврологию, эндокринологию, токсикологию и наркологию, инфекционные болезни, педиатрию, восстановительную медицину. Достаточно успешно используют эти препараты в хирургии, пульмонологии, гематологии, дерматологии, акушерстве и гинекологии. Такое многообразие областей применения ЯК обусловлено непосредственным участием сукцината в процессах тканевого дыхания и окислительного фосфорилирования в митохондриях.

Предпосылкой использования препаратов ЯК в кардиологии послужила, в первую очередь,

Голубев Р.В. 197022, Санкт-Петербург, ул. Л. Толстого, д. 17, ПСПбГМУ им. акад. И.П. Павлова. Тел.: (812) 234-57-36, e-mail: [email protected]

способность сукцината поддерживать энерго-синтезирующую способность клеток в условиях гипоксии. Исходя из ключевой роли атеросклероза в патогенезе сердечно-сосудистых заболеваний, наиболее радикальным методом лечения является восстановление нарушенного кровоснабжения. Однако у многих пациентов, в том числе у получающих заместительную почечную терапию, возможности хирургической реконструкции часто ограничены в силу наличия тяжелой сопутствующей патологии. Это обусловливает необходимость поиска других подходов в комплексном лечении поражений сердечно-сосудистой системы, например, оптимизацию использования кислорода клетками с помощью препаратов, действующих на внутриклеточный метаболизм и обладающих цитопротективными свойствами, т.е. способностью повышать энергосинтезирующую и энергосберегающую функцию клеток без изменения коронарной и системной гемодинамики [2-4].

В физиологических условиях основными субстратами для выработки энергии в кардиомиоцитах служат свободные жирные кислоты, обеспечивающие от 60 до 80% синтеза АТФ, и глюкоза (20-40% синтеза АТФ) [5, 6]. Глюкоза вначале подвергается анаэробному гликолизу с образованием небольшого, около 10% от общего, количества АТФ, а также пирувата, который поступает в митохондрии, где

Препараты янтарной кислоты, доступные в Российской Федерации

Коммерческое название препарата Действующее вещество Форма выпуска

«Мексикор»/«Мексидол»/ «Мексиприм»/«Медомекси»/ «Мексифин»/«Нейрокс» Этилметилгидроксипиридина сукцинат Капсулы 50, 100, 125 мг 5% раствор в ампулах по 2 и 5 мл

«Реамберин» Меглумина натрия сукцинат 1,5% раствор во флаконах 100-500 мл

«Ремаксол» На 1 л раствора: Янтарная кислота 5,28 г Меглумин 8,725 г Рибоксин 2 г Метионин 0,75 г Никотинамид 0,25 г Раствор во флаконах 200 и 400 мл

«Цитофлавин»/«Церебронорм» Янтарная кислота 300 мг Рибоксин 50 мг Никотинамид 25 мг Рибофлавин 5 мг Таблетки Ампулы 10 мл

«Лимонтар» Янтарная кислота 200 мг Лимонной кислоты моногидрат 50 мг Таблетки

«Когитум» (Франция) Ацетиламиноянтарная кислота Ампулы 250 мг — 10 мл для приема внутрь

«Янтарная кислота», «Янтавит» и др. (относятся к группе БАД) Янтарная кислота (Глюкоза) Таблетки 500 и 100 мг

«Митомин», «Янтарит» и др. (относятся к группе БАД) Янтарная кислота 100 мг Аскорбиновая кислота 50 мг (Глюкоза) Таблетки

«Энерлит» (относится к группе БАД) Сукцинат аммония 200 и 250 мг Капсулы, таблетки

происходит его окислительное декарбоксилирова-ние с образованием ацетил-КоА. Свободные жирные кислоты, поступая в цитоплазму кардиомиоци-та, превращаются в ацилкоэнзим А, который затем подвергается бета-окислению в митохондриях с образованием ацетил-КоА. Образующийся в ходе метаболизма глюкозы и жирных кислот ацетил-КоА поступает в цикл Кребса.

Необходимо особо подчеркнуть, что при окислении глюкозы на синтез одной молекулы АТФ расходуется на 35-40% меньше кислорода, чем при окислении жирных кислот (ЖК), не только за счет метаболических особенностей процесса окисления глюкозы, но и за счет отсутствия необходимости активного транспорта жирных кислот в митохондрии, при котором происходит потребление АТФ. В клетках ишемизированного миокарда тормозится процесс окисления глюкозы с одновременным повышением использования ЖК [7]. Увеличение утилизации свободных жирных кислот ведет к повышенному потреблению кислорода. В дальнейшем, при усугублении ишемии, блокируется и бета-окисление ЖК, а затем и анаэробный гликолиз, что приводит к исчерпанию ресурсов для энергообразования [7]. Такой дисбаланс, а также повышенная концентрация ЖК в ишемизирован-ной зоне являются важными факторами реперфу-зионного повреждения и дисфункции миокарда, развития опасных нарушений ритма сердца [5, 7].

Таким образом, наиболее эффективным путем энергообразования в условиях нормального снабжения миокарда кислородом является утилизация свободных жирных кислот, а в условиях ишемии миокарда предпочтительным является окисление глюкозы, так как этот путь позволяет расходовать кислород более экономно [5, 6, 8]. В лечебной практике широко используют препараты, блокирующие бета-окисление ЖК (р^ОХ-ингибиторы) и переключающие метаболизм кардиомиоцитов на окисление глюкозы. Известным представителем этой группы препаратов является триме-тазидин (предуктал). Триметазидин тормозит бета-окисление жирных кислот в митохондриях, блокируя последнюю реакцию процесса окисления жирных кислот (фермент 3-кетоацил-КоА-тиолазу) [5, 9, 10], что сопровождается относительным возрастанием роли гликолиза в миокарде с соответственным увеличением эффективности процесса энергобразования и одновременным уменьшением образования свободных радикалов на фоне блокады бета-окисления ЖК.

Наибольшее количество заслуживающих внимания данных о применении в кардиологии препаратов ЯК относится к препарату этилме-тилгидроксипиридина сукцинат (коммерческие названия «Мексидол», «Мексикор», «Мексиприм» и др.), представляющему собой комплексное соединение сукцината с эмоксипином, производным

3-оксипиридина. Эмоксипин, как и сукцинат, обладает отчетливой антиоксидантной активностью, однако принципиальное значение в данном случае имеет способность 3-оксипиридинов изменять физико-химические свойства клеточных мембран (уменьшать вязкость и увеличивать текучесть мембраны), активность мембраносвязанных ферментов (кальций-независимая фосфодиэстераза, аденилат-циклаза, ацетилхолинэстераза) и модифицировать тем самым транспортную и метаболическую функцию мембран [11]. Этилметилгидроксипиридина сукцинат в растворах диссоциирует на основание (2-этил-6-метил-3-оксипиридин) и янтарную кислоту. Основание активно депонируется в биологических мембранах, увеличивая их проницаемость для сукцината и улучшая его доступность к ферментам дыхательной цепи [12,13]. В эксперименте экспозиция изолированных митохондрий гепатоцитов крыс в растворе сукцината этилметилгидроксипиридина приводила к существенно большему приросту параметров эндогенного дыхания митохондрий, чем при изолированном применении 3-оксипиридина, и незначительно большему, чем при использовании только сукцината [14]. При добавлении конкурентного ингибитора сукцинатдегидрогеназы — малона-та — скорость эндогенного дыхания митохондрий снижалась примерно в 3 раза, при этом как сукци-нат, так и мексидол переставали ее стимулировать, что свидетельствует о том, что стимуляция дыхания митохондрий обусловлена активацией сукцинаток-сидазного пути окисления [14].

Активация сукцинатдегидроденазного пути стимулирует прямое окисление глюкозы. Клеточный метаболизм, таким образом, переключается с преимущественного окисления ЖК на окисление глюкозы. При этом, в отличие от триметазиди-на, который блокирует бета-окисление ЖК как в условиях гипоксии, так и при восстановлении коронарного кровотока, сукцинатсодержащие препараты при улучшении оксигенации миокарда не препятствуют окислению ЖК на фоне полного использования глюкозы в энергетической цепи. Вместе с тем, мексидол, повышая уровень восстановленных нуклеотидов, способствует сохранению уровня эндогенных антиоксидантов и усиливает антиоксидантную защиту клетки [7].

У больных с нестабильной стенокардией при применении мексикора в составе комплексной терапии происходило быстрое снижение концентрации первичных (диеновые конъюгаты, ДК) и вторичных (малоновый диальдегид, МДА) продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), начиная с 3-х суток введения препарата (на 31,2 и

24,9% соответственно). К 5-м суткам содержание продуктов ПОЛ снизилось на 53,1 и 49,8%, к 10-м суткам — на 71,0 и 65,5% соответственно (р<0,05). В группе сравнения (в отсутствие «Мексикора») содержание ДК и МДА начинало снижаться с 7-го дня наблюдения (на 33,1 и 24,3%), и к 10-м суткам снижение составило только 42,3 и 38,6% соответственно [15].

В острых экспериментах на модели коронароок-клюзионного инфаркта миокарда у крыс показано, что внутривенная инфузия «Мексикора» в дозе 50 мг/кг перед началом ишемии достоверно уменьшает размер инфаркта и уровень тропонина I, а также снижает частоту возникновения реперфузионной фибрилляции желудочков [16]. Аналогичные данные получены и зарубежными исследователями: применение сукцината при реперфузии ишемизи-рованного сердца крыс либо добавление сукцината в состав раствора для кардиоплегии приводило к значительному улучшению восстановления сердечной функции после ишемии по сравнению с контролем [17,18]. Это дает дополнительные основания полагать, что положительные эффекты мексикора напрямую связаны с входящим в его состав сукцинатом.

Значительный интерес вызывают данные отечественного открытого рандомизированного исследования эффективности мексикора с участием 338 больных с острым коронарным синдромом и гипертонической болезнью кризового течения [15]. Больным из контрольной группы проводили традиционное лечение. Пациенты основной группы дополнительно получали мексикор в дозе 6-9 мг/кг/сут. У больных острым инфарктом миокарда при лечении мексикором к 14-м суткам наблюдалось снижение числа зон акинезии на 42,2%. В группе сравнения достоверной динамики этого показателя не отмечено. Число зон дискинезии в основной группе с 14-х по 24-е сутки уменьшилось в 1,5 раза, в то время как в группе сравнения число зон дискинезии увеличилось в 2,6 раза (вероятно, за счет формирования у ряда больных аневризмы сердца). Индекс сократимости в 1-е сутки инфаркта был существенно повышен в обеих группах, что свидетельствовало о наличии выраженных нарушений сократимости левого желудочка. К 24-м суткам при лечении мексикором индекс сократимости уменьшился на 11,2%, в то время как в группе сравнения он существенно не изменился. Время изоволемического расслабления левого желудочка (IVRT) существенно превышало норму в 1-е сутки инфаркта в обеих подгруппах. При лечении мекси-кором к 14-м суткам наблюдалось его уменьшение

на 17%, в то время как аналогичное уменьшение IVRT (на 15,2%) в контрольной группе отмечено лишь к 24-м суткам [15].

Анализ результатов холтеровского монитори-рования у больных с нестабильной стенокардией показал, что в обеих группах частота и продолжительность ишемических эпизодов в 1-е сутки достоверно не различались. В дальнейшем у больных, получавших мексикор, частота и продолжительность периодов ишемии сократилась к 5-м суткам на 66,7 и 67,8%, к 10-м суткам — на

88.1 и 83,4% соответственно. В группе сравнения частота и продолжительность периодов ишемии к 5-м суткам снизились только на 38,7 и 41,9%, к 10-м суткам — на 58,9 и 66,8% соответственно. Суммарный интеграл смещения сегмента БТ в основной подгруппе к 5-м суткам уменьшился на 79,7%, к 10-м — на 82,1%. В контрольной группе его изменения были менее выраженными: уменьшение к 5-м суткам — на 31,0%, к 10-м — на 51,8%. Таким образом, включение мексикора в комплексную терапию нестабильной стенокардии способствовало более выраженному, чем в группе сравнения, уменьшению частоты, продолжительности и выраженности ишемии миокарда [15].

Анализ результатов применения мексикора у больных с кризовым течением гипертонической болезни показал, что хотя исходные уровни АД в основной группе (205 ± 29 / 112 ± 18 мм рт. ст.) и в группе сравнения (203 ± 25 / 111 ± 16 мм рт. ст.) достоверно не различались, средний срок полного купирования жалоб больных и стабилизации АД в основной группе (2,6 ± 0,2 сут) был достоверно меньше, чем в группе сравнения (3,7 ± 0,08 сут). Таким образом, применение мексикора в комплексной терапии гипертонической болезни на этапе посткризовой стабилизации сопровождалось дополнительным гипотензивным влиянием [15].

В другом исследовании у больных с артериальной гипертензией стабильного течения показано, что сочетанная терапия мексикором (0,3 г/сут) и эналаприлом (20-30 мг/сут) более эффективно снижает артериальное давление, чем монотерапия эналаприлом. В основной группе к 10-м суткам терапии среднесуточное систолическое и диа-столическое артериальное давление снижалось на 15,6 и 17,5% соответственно, а к 30-м суткам — на

25.2 и 26,4%. В контрольной группе (монотерапия эналаприлом) соответствующие показатели составили к 10-м суткам 9,2 и 5,2%, а к 30-м суткам -16,6 и 11,3% (р<0,05) [19]. При этом применение комбинации мексикора с эналаприлом приводило к достоверно большему приросту диаметра плече-

вой артерии при пробе с реактивной гиперемией, что свидетельствовало о способности мексикора улучшать эндотелийзависимую вазодилатацию и восстанавливать функциональную активность эндотелия сосудов.

Необходимо подчеркнуть, что в обоих случаях речь шла об использовании мексикора в составе комплексной терапии гипертонической болезни, т.е. о потенцировании мексикором антигипер-тензивного действия ингибиторов ангиотензин-превращающего фермента и бета-блокаторов. Собственным гипотензивным действием мексикор не обладает. Усиление антигипертензивного эффекта при сочетанной терапии можно объяснить антиоксидантным действием мексикора и его способностью корригировать эндотелиальную дисфункцию. Важным патогенетическим фактором развития и прогрессирования артериальной гипер-тензии является усиление активности процессов свободнорадикального окисления, что приводит, в частности, к снижению концентрации монооксида азота. Артериальная гипертензия, как правило, сочетается с выраженной дисфункцией эндотелия, что не только усугубляет тяжесть гипертензии, но и существенно снижает эффективность гипотензивных средств, реализующих свою фармакологическую активность через эндотелиальные механизмы регуляции сосудистого тонуса [2].

Помимо потенцирующего эффекта мексикора по отношению к гипотензивным препаратам, в эксперименте показано, что мексикор, практически не влияя на тонус коронарной артерии самостоятельно, существенно увеличивает вазодилатирующее действие нитроглицерина [3].

Оксидативный стресс играет значительную роль и в возникновении ишемических аритмий. Эктопический очаг, как правило, располагается вблизи зоны ишемии, что было доказано при помощи метода позитронной эмиссионной томографии [20]. Внутриклеточная аккумуляция недоокисленных продуктов катаболизма жирных кислот, образующихся в результате замедления процессов бета-окисления, оказывает ингибирующее действие на метаболизм клетки и приводит к повреждению клеточных мембран. Мексикор продемонстрировал выраженное антиаритмическое действие в отношении ишемических желудочковых нарушений ритма. В результате применения мексикора в суточной дозе 300 мг при анализе результатов хол-теровского мониторирования выявлен достоверный положительный эффект в отношении одиночных и парных желудочковых экстрасистол, а также эпизодов желудочковой тахикардии [20]. Применение

мексикора позволило к 5-м и 10-м суткам терапии сократить общее число аритмических эпизодов на 81,7 и 91,8% соответственно, в то время как в контрольной группе данные показатели составили 23,4 и 44,7%, р<0,05. Помимо антиаритмического действия препаратов янтарной кислоты, показана также их способность уменьшать кардиодепрессив-ное и гипотензивное действие антиаритмических препаратов [21].

Внутрикоронарное введение мексикора после восстановления кровотока в инфаркт-ответственной коронарной артерии уменьшало реперфузионное повреждение миокарда [2]. В исследование был включен 51 пациент с острым инфарктом миокарда с полной окклюзией коронарной артерии. Всем больным в первые 6 ч от начала заболевания были выполнены селективная коронарография, успешная процедура реканализации и ангиопластики коронарной артерии. У 32 больных (основная группа) после первой дилатации инфаркт-ответственной артерии в нее вводили мексикор (200 мг на 150 мл физиологического раствора), а затем осуществляли внутривенное (3 раза в сутки в течение 5 дней), а затем внутримышечное введение мексикора (3 раза в сутки в течение 9 дней) с последующим переходом на пероральный прием препарата. Все больные получали традиционную терапию нитратами, бета-адреноблокаторами и дезагрегантами. В основной группе уровень тропонина I (512,7±63,6 нг/мл) и миоглобина (143,5±18,5 нг/мл) к 12-му часу лечения был достоверно (р<0,05) ниже, чем в группе сравнения (671,1±84,3 и 203,5±17,4 нг/мл соответственно) [2]. Также в основной группе был отмечен достоверный прирост показателя фракции выброса на 10-е сутки лечения, в то время как в контрольной группе изменений данного показателя выявлено не было. Применение мексикора, таким образом, ускоряло восстановление систолической функции левого желудочка.

В 2006 году мексикор был включен в стандарт оказания экстренной помощи больным с острым инфарктом миокарда и стенокардией (приказ МЗ РФ № 671 от 25.09.2006 г.).

Среди других сукцинатсодержащих лекарственных препаратов наиболее востребован в кардиологической практике реамберин (1,5% раствор меглу-мина натрия сукцината). Реамберин используют как компонент кардиопротективной терапии, в том числе во время хирургических операций на сердце и в послеоперационном периоде. Так, длительная (3-6 ч) инфузия реамберина со скоростью 0,3-1,5 мг/кг/мин во время 30 операций по реваскуляри-зации миокарда позволила полностью устранить

послеоперационные нарушения ритма и необходимость послеоперационной инотропной поддержки, отмечавшиеся в контрольной группе (30 пациентов с аналогичной патологией, возрастом, массой тела)

[22]. Реамберин включен в перечень жизненно необходимых и важнейших лекарственных средств распоряжением Правительства России № 376-р от 29 марта 2007 г.

Описанные в литературе кардиотропные эффекты сукцината имеют большое значение для больных с терминальной почечной недостаточностью (ТПН), получающих заместительную почечную терапию. Больные с хронической болезнью почек (ХБП) имеют значительно повышенный риск поражения сердечно-сосудистой системы. Осмысление общности факторов риска сердечно-сосудистых заболеваний и ХБП привело к формированию концепции кардиоренального континуума, т.е. взаимообусловленности патологических процессов в сердечно-сосудистой системе и почках

[23]. Помимо «традиционных» факторов риска (артериальная гипертензия, дислипидемия, нарушение толерантности к глюкозе), у больных с ХБП значительную роль в прогрессировании сердечнососудистой патологии играют «нетрадиционные» факторы: нарушения кальций-фосфорного обмена, воспалительный и оксидативный стресс, анемия, гипергомоцистеинемия [23, 24].

Сердечно-сосудистая заболеваемость и летальность нарастают по мере снижения скорости клу-бочковой фильтрации и достигают максимума у больных, получающих заместительную почечную терапию [25-28]. После начала диализного лечения нарастает выраженность специфических факторов риска, обусловленных ТПН (гипертриглицериде-мия, гипоальфахолестеринемия, эндотелиальная дисфункция, оксидативный и воспалительный стрессы, анемия, гиперфосфатемия), а также появляются новые, специфичные для этой группы больных состояния (артериовенозная фистула и связанное с ней увеличение объемной нагрузки на сердце, оксидативный и воспалительный стрессы, обусловленные контактом крови с чужеродными материалами мембраны диализатора и кровопрово-дящей системы) [24, 29-31]. Это приводит к тому, что у больных на гемодиализе сердечно-сосудистая смертность в несколько раз превышает таковую в общей популяции, а у пациентов молодого возраста (25-35 лет) этот риск возрастает более чем в 300 раз [32].

В основе поражения сердечно-сосудистой системы при ХБП лежит атеросклеротический процесс. Концепция «ускоренного атеросклероза» у боль-

ных, получающих лечение хроническим гемодиализом, была выдвинута A. Lindner et al. еще в 1974 году [33]. При этом одно из ведущих мест в процессе формирования сердечно-сосудистых осложнений занимает гипертрофия левого желудочка (ГЛЖ). Риск сердечно-сосудистых осложнений нарастает параллельно увеличению массы левого желудочка [34]. Наличие ГЛЖ увеличивает риск возникновения аритмий, в том числе фибрилляции предсердий, а также приводит к развитию диасто-лической дисфункции сердца и сердечной недостаточности. Вклад в ремоделирование сердца вносят многие факторы, среди которых артериальная ги-пертензия, вторичный гиперпаратиреоз и дефицит кальцитриола, анемия [35-40]. Многочисленные данные свидетельствуют о влиянии артериосклероза и фиброза миокарда на прогрессирование ГЛЖ [36, 41, 42]. Наконец, экспериментальные исследования продемонстрировали, что уремические токсины вызывают гипертрофию кардиомиоцитов как компенсаторную реакцию на повреждение, активируют процессы интерстициального роста и фиброза, способствуя ремоделированию миокарда [43, 44]. При эхокардиографическом обследовании миокардиальная дисфункция отмечена у двух третей больных на гемодиализе, не имеющих клинических признаков ишемической болезни сердца, в том числе у детей [45].

При ХБП неоангиогенез, необходимый при нарастании массы миокарда и обеспечивающий адекватную капилляризацию миокарда в условиях ГЛЖ, ингибирован, что нашло подтверждение как в экспериментальных работах, так и при аутопсиях пациентов с ХБП [46-48]. Механизмы, которые ингибируют неоангиогенез, до настоящего времени подробно не изучены. Известно, однако, что повышение содержания сукцината в ишемизированной сетчатке глаза, активируя GPR-91, приводит к увеличению продукции ряда факторов ангиогенеза, в том числе фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) [49]. Вероятным механизмом является ингибирова-ние гидроксилаз, ответственных за дезактивацию индуцированного гипоксией фактора (HIF), что приводит к увеличению транскрипции VEGF [50, 51]. Таким образом, назначение сукцинатсодержа-щих препаратов может способствовать улучшению миокардиальной перфузии.

Самостоятельным и весьма значительным фактором риска сердечно-сосудистой заболеваемости и смертности у больных на гемодиализе является гиперфосфатемия [52, 53]. Показано, что даже у лиц с нормальной функцией почек повышенный уровень неорганического фосфата в крови связан

с более выраженным атеросклеротическим процессом и высокой смертностью [54, 55].

Анализ влияния изолированной гиперфосфате-мии на заболеваемость и смертность у больных с ХБП затрудняет наличие связанных с ней факторов, также ассоциированных с выживаемостью: вторичного гиперпаратиреоза, дефицита витамина D, анемии, артериальной гипертензии и др. По данным многочисленных работ, гиперфосфатемия способствует прогрессированию эктопической кальцификации, атеросклероза, приводит к развитию гипертрофии и фиброзу миокарда, способствует возникновению и прогрессированию сердечной недостаточности [52-56].

Гиперфосфатемия вносит существенный вклад в развитие кальцификации сосудов [56-59]. Показано, что высокий уровень неорганического фосфата (Фн) в крови способствует сосудистой кальцифи-кации благодаря двум механизмам: трансдифференциации гладкомышечных сосудистых клеток в хондро- и остеобласты, вследствие повышения уровня фактора транскрипции RUNX2, а также индукции апоптоза вследствие ингибирования пути выживания клеток gas6/Axl/PI3K/Akt [60, 61]. Под влиянием гиперфосфатемии отмечено повышение синтеза таких факторов кальцификации, как остеокальцин, остеопонтин, костный морфогенный протеин-2 (BMP-2) [60]. Существуют данные о том, что вызванное гиперфосфатемией образование нанокристаллов индуцирует (апрегулирует) гены BMP-2 и остеопонтина в гладкомышечных клетках сосудов крыс [62].

Процесс кальцификации затрагивает не только срединную оболочку артерий, как это было принято считать ранее, но происходит и в интиме сосудов [63]. Последний вариант развития патологического процесса дестабилизирует состояние бляшки, что способствует тромбозу сосуда и возникновению серьезных сердечно-сосудистых осложнений (рис. 1).

Важным фактором, запускающим процесс атерогенеза, является эндотелиальная дисфункция [64, 65]. Получены сведения о связи между гиперфосфатемией и развитием эндотелиальной дисфункции, но механизм этой связи остается не до конца изученным. В эксперименте в условиях гиперфосфатемии эндотелиальные клетки аорты быков увеличивали продукцию активных форм кислорода, что связывали с ингибированием продукции монооксида азота (NO) вследствие фосфо-рилирования эндотелиальной NO-синтетазы [66]. В другом исследовании in vitro было показано, что высокая концентрация Фн, аналогичная таковой

Атерогенез ХБП Са/Р

+ Са/Р 1

Калыдафикация интимы

I

Нестабильное состояние бляшки

I

Тромбоз

I

ОИМ, ОНМК, нарушения ритма сердца, СН

Кальцификация медии

/ X

Нарушение регуляции сосудистого тонуса

I

Гемодинамичес кая нестабильность

Повышение жесткости сосудов

I

Повышение САД Снижение ДАД

ч /

Усугубление ишемии миокарда

Неблагоприятный исход

Рис. 1. Сосудистая кальцификация и ее последствия при ХБП.

при уремии (более 2,5 ммоль/л), вызывает апоптоз эндотелиальных клеток [67].

Показано, что даже активная медикаментозная коррекция артериальной гипертензии и анемии у диализных пациентов не предотвращает развитие ГЛЖ [68]. В ряде исследований была выявлена прямая связь между уровнем гиперфосфатемии и выраженностью ГЛЖ [69-71]. Гиперфосфатемия может вызывать гипертрофию миокарда косвенно за счет повышения артериального давления (АД), увеличения жесткости сосудов вследствие атеросклероза и кальциноза. Имеются данные, что у пациентов с гиперфосфатемией по сравнению с больными, имеющими уровень Фн в пределах целевых значений, выше диастолическое и среднее АД [72]. Но предполагается наличие и дополнительного, не связанного с сосудистой кальцификацией, механизма, реализующего влияние гиперфосфатемии на развитие ГЛЖ у диализных пациентов. Так, показано, что достижение контроля уровня Фн с помощью ежедневного ночного гемодиализа в течение 12 мес приводит к регрессу ГЛЖ, не уменьшая при этом сосудистую кальцификацию [68, 71]. В опытах на животных было установлено, что вызванная субтотальной нефрэктомией и назначением диеты с высоким содержанием фосфатов гиперфосфатемия ведет к развитию ГЛЖ без возникновения кальцификации сосудов [73]. Является ли этот эффект следствием повышения сопротивления сосудов из-за изменения их реактивности или вследствие эндотелиальной дисфункции, либо результатом прямого влияния на миокард, пока не установлено.

Таким образом, вероятные механизмы связи гиперфосфатемии с поражением сердечнососудистой системы представляются следующим образом: гиперфосфатемия вызывает эндотелиаль-ную дисфункцию, способствует кальцификации сосудов и сердечных клапанов. Прямое воздействие на миокард — один из предполагаемых факторов развития ГЛЖ. Гипертензия при гиперфосфате-мии обусловлена, вероятно, артериосклерозом и кальцификацией сосудов. Прогрессирующий атеросклероз вследствие эндотелиальной дисфункции, кальцификация сосудов и клапанов, гипертрофия миокарда, а также артериальная гипертензия ведут к ишемии миокарда, сердечной недостаточности, что обусловливает неблагоприятный исход (рис. 2).

Сведений о влиянии сукцинатсодержащих препаратов на уровень Фн в крови в литературных источниках обнаружить не удалось, но можно предположить, что применение препаратов ЯК будет способствовать коррекции гиперфосфатемии вследствие увеличения связывания Фн при активизации синтеза макроэргических соединений. Данное предположение подтвердилось при изучении результатов применения сукцинатсодержащих диа-лизирующих растворов у больных, находящихся на лечении хроническим гемодиализом [74, 75]. У пациентов, получавших в течение 6 мес гемодиализ с применением сукцинатсодержащего диализирую-щего раствора, показатели концентрации Фн в крови и кальций-фосфорного произведения оказались достоверно ниже, чем в контрольной группе, при том, что исходно группы по этому показателю не различались [74, 75].

Гиперфосфатемия

Гипертрофия миокарда

Кальцификация сосудов и клапанов

Эндотелиальная дисфункция

Таким образом, применения препаратов ЯК показано как при острой, так и при хронических формах ишемической болезни сердца. Это особенно важно тогда, когда проведение реконструктивной операции на коронарных артериях невозможно, а резервы стандартной терапии исчерпаны. Такая ситуация часто возникает в практике современного гемодиализа в связи с прогрессивным возрастанием числа больных старшего возраста с тяжелой сердечно-сосудистой патологией, а также больных с сахарным диабетом, получающих заместительную почечную терапию.

Применение препаратов ЯК в других областях медицины

В неврологии одним из перспективных путей улучшения энергетического обмена нейронов и клеток глии в условиях гипоксии считается стимуляция метаболической цепи цикла Кребса. Одним из способов достижения такого эффекта является использование сукцинатсодержащих препаратов. Помимо антигипоксического и антиоксидантного эффектов, препараты ЯК оказывают ноотропное, противосудорожное и анксиолитическое действие [76-78]. Препараты данной группы модулируют активность ферментов клеточных мембран (Са2+-независимой фосфодиэстеразы, аденилатциклазы, ацетилхолинэстеразы), рецепторных комплексов (бензодиазепинового, ГАМК, ацетилхолинового), способствуя их связыванию с лигандами, сохранению структурно-функциональной организации биомембран, транспорта нейромедиаторов и улучшению синаптической передачи; повышают концентрацию в головном мозге дофамина, усиливают компенсаторную активацию аэробного гликолиза [76, 79].

Рис. 2. Влияние гиперфосфа-темии на развитие сердечнососудистой патологии.

В эксперименте применение ЯК при острой ишемии головного мозга у лабораторных крыс приводило к уменьшению деструкции нейронов, снижению концентрации продуктов ПОЛ, ионов аммония, а-аланина, нормализации коэффициента сопряженности окислительного фосфорилирова-ния и, в конечном счете, к увеличению выживаемости [80].

В исследовании с участием 200 пациентов при проведении длительного мониторинга функционального состояния мозга путем оценки на-тивных электроэнцефалограмм, картирования и спектрального анализа ЭЭГ была показана эффективность применения этилметилгидрокси-перидина сукцината в отношении выраженности клинических проявлений, течения, исходов и функционального состояния головного мозга у больных при церебральном ишемическом инсульте [81]. По сравнению с контрольной группой, получавшей базисную терапию, были отмечены более быстрые темпы регресса расстройств сознания, афатических, моторных, чувствительных и координаторных нарушений, что подтверждалось отчетливой положительной динамикой электроэнцефалографических изменений (восстановление а-ритма, снижение уровня межполушарной асимметрии). Было показано, что смертность в основной группе, получавшей сукцинатсодержа-щий препарат, была на 15% ниже, чем в группе, получавшей базисную терапию. Частота благоприятных исходов в основной группе составляла 73%, в контрольной — только 58%. При этом проводимая терапия не сопровождалась развитием значимых побочных и нежелательных реакций.

При назначении сукцинатсодержащих препаратов («Мексидол», «Реамберин») в первые часы пребывания в отделении интенсивной терапии больных с ишемическим инсультом происходило достоверно более быстрое улучшение клинико-лабораторных показателей, восстановление ней-родинамики и реактивности центральной нервной системы, снижение концентрации в крови лактата и креатинфосфокиназы [77, 82].

Эффективным оказалось применение реамбе-рина у больных с синдромом полиорганной недостаточности, развившимся на фоне критических состояний, связанных с гипоксическими факторами (клиническая смерть, наркозные осложнения, циркуляторные гиповолемические расстройства с вторичной гипоксией). При введении реамберина непосредственно после клинической смерти были отмечены значительная положительная динамика в виде активации сознания от комы IV до сопора, быстрое восстановление спонтанного дыхания, стабилизация параметров системного гомеостаза, уменьшение выраженности расстройств мышечного тонуса и вегетативно-дистрофических расстройств [78].

Таким образом, препараты ЯК могут применяться как при острых состояниях, в том числе одновременно с проведением нейровегетативной блокады, так и в восстановительном периоде после состоявшейся мозговой катастрофы.

Достаточно широко применяют сукцинатсодер-жащие препараты в эндокринологии, особенно при лечении осложнений сахарного диабета, таких как синдром диабетической стопы и сенсомоторная полиневропатия. Лечение больных с сахарным диабетом, осложненным диабетической полиней-ропатией, реамберином приводило к редукции нейропатической симптоматики, оцениваемой с помощью шкал нейропатического симптоматического счета (НСС) и нейропатического дисфункционального счета (НДС). В основной группе суммарный балл по шкале НСС, составлявший в контрольной группе 5,07±0,45, уменьшился до 1,53±0,26 (р<0,05), а суммарный балл по шкале НДС снизился с 15,97±0,79 до 10,58±0,98 (р<0,05). Таким образом, в результате лечения реамберином в течение 14 дней клинические показатели диабетической нейропатии переместились из диапазона «выраженной нейропатии» (14-28 баллов по шкале НДС) в область «умеренной нейропатии» (5-13 баллов) [83].

Применение ЯК в суточной дозе 1,5 г перораль-но в течение 1 мес у пожилых больных с сахарным диабетом (26 больных в возрасте 60-76 лет) при-

вело к достоверному уменьшению проявлений по-линейропатии и улучшению параметров качества жизни (уменьшение депрессии и тревожности, улучшение кратковременной памяти) [84]. В ряде других плацебо-контролируемых проспективных исследований установлено, что использование ре-амберина приводит к достоверному уменьшению проявлений диабетической нейро- и ангиопатии, сокращает сроки пребывания в стационаре, отдаляет сроки выполнения ампутации нижних конечностей [85-87]. У больных с диабетической макроангиопатией нижних конечностей и синдромом диабетической стопы, получивших в дополнение к базисной терапии курс из 10 инфузий реамберина, дистанция ходьбы до возникновения болевых ощущений увеличивалась более чем в 2 раза у 88% больных против 35% в группе сравнения, р<0,001 [87].

При приеме больными с сахарным диабетом мексикора происходит увеличение активности В-клеток поджелудочной железы и снижение инсулинорезистентности [85]. Моноэтиловый эфир ЯК рассматривают как перспективный ин-сулинотропный препарат при лечении сахарного диабета. В эксперименте у крыс со стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом эффективность этого препарата в отношении снижения уровня гликемии была сопоставимой с эффектом метформина [88].

10-дневный курс инфузий цитофлавина у больных с облитерирующим атеросклерозом нижних конечностей привел к увеличению максимальной проходимой дистанции на 30,1% в группе некурящих больных и на 130,5% у курильщиков [89].

При хронических вирусных гепатитах необходимость фармакологической коррекции нарушения энергетического обмена клеток и клеточного метаболизма определяется значительной ролью окислительного стресса в патогенезе поражений ткани печени и выраженностью побочных эффектов заместительной терапии препаратами интерферона. Показаниями для назначения антигипоксантов в комплексной терапии больных с гепатитами служат наличие цитолитического синдрома, проявления мезенхимально-воспалительной реакции, недостаточности гепатоцитов, ферментативного и неферментативного звеньев системы антиокси-дантной защиты, выраженность процессов липо-пероксидации [90, 91]. В результате применения сукцинатсодержащих препаратов («Реамберин», «Цитофлавин») происходило снижение выраженности цитолиза гепатоцитов, проявлялся иммуно-корригирующий эффект, возрастало абсолютное

количество лимфоцитов и тромбоцитов, повышалась степень ответа на противовирусную терапию (в том числе у 12 (27%), из 44 ранее на нее не отвечавших больных) [91-93]. Использование этих препаратов при лечении больных с вирусными гепатитами наркозависимых лиц сопровождалось ярко выраженным дезинтоксикационным эффектом с благоприятным исходом крайне тяжелых состояний, в том числе печеночной комы [92].

Сукцинатсодержащие препараты применяют и в оперативной гепатологии, где повреждающее действие на печень ухудшает ее детоксицирующую и биотрансформирующую функции, усугубляет ксенобиотическую нагрузку, вызывает энергодефицит в гомеостатических системах организма [94].

Как известно, отношение лактат/пируват отражает соотношение процессов аэробного и анаэробного гликолиза и, соответственно, степень тканевой гипоксии [95]. В рандомизированном исследовании, включившем 259 больных с разлитым перитонитом, осложненным синдромом полиорганной недостаточности, максимальное (на 52,8%) снижение этого показателя к 5-м суткам лечения отмечено в группе больных, которые получали инфузии реамберина, что свидетельствует о выраженном антигипоксантном действии этого препарата. В 6 группах сравнения, получавших лечение без применения реамберина, этот показатель составил 25, 8, 19, 3, 22,1 и 39,3% соответственно, что достоверно (р<0,01) ниже, чем в основной группе [96]. Применение реамберина у 59 больных с тяжелыми интраабдоминальными инфекциями, осложненными септическим шоком, имело результатом более быстрое (в среднем на 2,5 дня) разрешение воспалительного синдрома по сравнению с группой сравнения, а также привело к снижению летальности (20,7% против 26,7% в контрольной группе, р<0,05) [97].

Тяжелое течение пневмонии сопровождается гипоксией тканей и выраженной интоксикацией на фоне вторичного иммунодефицита. Реамберин, обладающий антиоксидантным и антигипоксическим эффектом, рекомендован для комплексной терапии больных с тяжелой пневмонией. Отмечено также иммуномодулирующее и дезинтоксикационное действие реамберина [98]. Острые нагноения легких и плевры относятся к числу наиболее тяжелых форм гнойной инфекции. Одними из ключевых звеньев патогенеза при этом являются эндотоксикоз и гипоксия. При данной патологии сочетаются практически все, но в различной степени выраженные, виды гипоксии: респираторная, гемическая, гемодинамическая, тканевая. При

использовании сукцинатсодержащих препаратов в комплексном лечении острых инфекционных деструкций легких (37 больных — острый абсцесс легкого и 6 больных — гангрена легкого) отмечено уменьшение признаков гнойной интоксикации, более быстрое купирование синдрома системной воспалительной реакции, сокращение сроков пребывания в стационаре [99].

Препараты ЯК («Реамберин», «Мексидол») успешно используют в гинекологии и при родовспоможении [100, 101], комплексной терапии перинатальной гипоксии [102] и анестезиологическом обеспечении новорожденных [103], в педиатрии [104].

Реамберин и цитофлавин активно применяют в восстановительной медицине, у больных, уже переживших мозговую или сердечно-сосудистую катастрофу. Отмечена суммация положительных эффектов традиционного лечения и инфузионной терапии сукцинатсодержащими препаратами в виде снижения функционального класса стенокардии, улучшения биохимических показателей крови, регресса неврологической симптоматики, увеличения проходимой дистанции при облитерирующих заболеваниях нижних конечностей, улучшения памяти и концентрации внимания [105,106].

Известно о применении реамберина в дерматологии. После 7-11-дневного курса реамберина в дополнение к базисной терапии при обострении псориаза клиническое выздоровление либо значительное улучшение отмечены у 50% больных против 30% в контрольной группе [107]. В патогенезе псориаза большое значение имеют процессы свободнорадикального окисления: у больных в прогрессирующей стадии уровень маркеров пере-кисного окисления липидов (диеновые конъюгаты, малоновый диальдегид) повышен в среднем в 2-2,5 раза [108]. Таким образом, в данном случае ведущую роль, по-видимому, играет антиоксидантное действие сукцината.

Как следует из приведенных данных, препараты ЯК находят эффективное применение во многих областях медицины. Их использование является патогенетически обоснованным и эффективным как для монотерапии, так и в сочетании с другими препаратами, когда они дополняют и потенцируют действие последних.

БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК

1. Маевский ЕИ, Гришина ЕВ, Розенфельд АС и др. Анаэробное образование сукцината и облегчение его окисления — возможные механизмы адаптации клетки к кислородному голоданию. Биомеджурн 2000; (1): 32-36

2. Белоусов ЮБ, ред. Современный подход кцитопротек-торной терапии. М., 2010; 30

3. Голиков АП, Полумисков ВЮ, Михин ВП и др. Антиокси-данты — цитопротекторы в кардиологии. Кардиоваск терапия и профилактика 2004; 6(2): 66-74

4. Шляхто ЕВ, Галагудза ММ, Нифонтов ЕМ и др. Метаболизм миокарда при хронической сердечной недостаточности и современные возможности метаболической терапии. Серд недостаточность 2005; (4): 148-155

5. Олесова ВМ, Маркатюк ОЮ, Юрова ЮЮ, Обрезан АГ. Метаболизм миокарда и препараты метаболического действия. Кардиология 2013; (1): 66-71

6. Stanley WC, Recchia FA, Lopaschuk GD. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiol Rev 2005; 85(3): 1093-1129

7. Стаценко МЕ, Туркина СВ, Лемперт БА, Евтерева ЕД. Использование метаболических средств в комплексной терапии ишемической болезни сердца. Леч врач 2012; (3): 81-84

8. Ingwall JS. Energy metabolism in heart failure and remodelling. Cardiovasc Res 2009; 81(3): 412-419

9. Тугушева ФА, Куликова АИ, Коношкова РЛ. О влиянии предуктала-20 на ишемию миокарда и показатели липоперок-сидации в крови больных с хронической почечной недостаточностью, получающих регулярный гемодиализ. Нефрология 1997; 1(2): 73-78

10. Fragasso G, Perseghin G, De Cobelli F et al. Effects of metabolic modulation by trimetazidine on left ventricular function and phosphocreatine/adenosine triphosphate ratio in patients with heart failure. Eur Heart J 2006; 27(8): 942-948

11. Смирнов ЛД, Дюмаев КМ. 3-оксипроизводные ше-стичленных азотистых гетероциклов. Синтез, ингибирующая активность и биологические свойства. Хим-фарм журнал 1982; 16(4): 28-44

12. Лукьянова ЛД, Атабаева РЕ, Шепелева СЮ. Биоэнергетические механизмы антигипоксического действия сукци-натсодержащего производного 3-оксипиридина мексидола. Бюлл экспер биол и мед 1993; 115(3): 366-367

13. Голиков АП, Полумисков ВЮ, Михин ВП и др. Метаболический цитопротектор мексикор в терапии стабильной стенокардии напряжения. Агрокурорт 2005; 2(20): 13-20

14. Лукьянова ЛД, Романова ВЕ, Чернобаева ГН и др. Особенности антигипоксического действия мексидола, связанные с его специфическим влиянием на энергетический обмен. Хим-фарм журн 1990; 24(8): 9-11

15. Голиков АП, Михин ВП, Полумисков ВЮ и др. Эффективность цитопротектора мексикора в неотложной кардиологии. Тер арх 2004; 76(4): 60-65

16. Сыренский АВ, Галагудза ММ, Егорова ЕИ и др. Влияние изменения метаболического и антиоксидантного статуса миокарда на выраженность его ишемического и реперфу-зионного поражения. Рос. физиол журн им Сеченова 2008; 94(10): 1171-1180

17. Cairns CB, Ferroggiaro AA, Walther JM et al. Postishemic administration of succinate reverses the impairment of oxidative phosphorylation after cardiac ischemia and reperfusion injury. Circulation 1997; 96(Suppl.9): 260-265

18. Sakamoto M, Takeshige K, Yasui H, Tokunaga K. Cardioprotective effect of succinate against ishemia/reperfusion injury. Surg Today 1998; 28(5): 522-528

19. Хлебодаров ФЕ, Михин ВП, Мезенцева НЛ, Забелина ИВ. Влияние сочетанной терапии мексикором и ингибиторами ангиотензинпревращающего фермента на суточный профиль артериального давления и эндотелийзависимую дилатацию плечевой артерии у больных артериальной гипертензией. Мед вестн МВД 2005; 15(2): 5-8

20. Шляхто ЕВ, Трешкур ТВ, Пармон ЕВ и др. Возможности метаболической терапии у больных ишемическими желудочковыми аритмиями. Вестнаритмол 2006; (44): 5-11

21. Котляров АА, Сернов ЛН. Особенности комбинированного применения мексикора с некоторыми антиаритмическими препаратами при острой окклюзии коронарной артерии в эксперименте. Рос кардиолжурнал 2003; (5): 77-82

22. Николаев АА, Оболенский СВ, Николаев АВ. Кардио-протекторное действие поликомпонентного антигипоксанта на основе реамберина в коронарной хирургии на работающем сердце. Регион кровоснабжи микроцирк 2002; 1(2): 88-89

23. Смирнов АВ, Добронравов ВА, Каюков ИГ. Кардио-ренальный континуум: патогенетические основы превентивной нефрологии. Нефрология 2005; 9(3): 7-15

24. Добронравов ВА, Жлоба АА, Трофименко ИИ. Гипер-гомоцистеинемия как системная проблема с точки зрения нефролога. Нефрология 2006; 10(2): 7-17

25. Смирнов АВ, Седов ВМ, Лхаахуу Од-Эрдэне и др. Снижение скорости клубочковой фильтрации как независимый фактор риска сердечно-сосудистой болезни. Нефрология 2006; 10(4): 7-17

26. Смирнов АВ, Каюков ИГ, Добронравов ВА. Концепция факторов риска в нефрологии: вопросы профилактики и лечения хронической болезни почек. Нефрология 2008; 12(1): 7-13

27. Anavekar NS, Pfeffer MA. Cardiovascular risk in chronic kidney disease. Kidney Int 2004; 66(Suppl. 92): S11-15

28. Henry RM, Kostense PJ, Bos G et al. Mild renal insufficiency is associated with increased cardiovascular mortality: the Hoorn Study. Kidney Int 2002; 62(4): 1402-1407

29. Волков ММ, Смирнов АВ, Добронравов ВА и др. Кальциноз сердечных клапанов у пациентов с хронической болезнью почек. Клин мед 2009; 87(6): 31-35

30. Смирнов АВ, Каюков ИГ, Есаян АМ и др. Превентивный подход в современной нефрологии. Нефрология 2004; 8(3): 7-14

31. Волков ММ. Биохимические показатели фосфорно-кальциевого обмена у пациентов с хронической болезнью почек 1-5 стадий. Нефрология 2009; 13(3): 49-51

32. Foley RN, Parfrey PS, Sarnac MJ. Epidemiology of cardiovascular disease in chronic renal disease. Am J Kidney Dis 1998; 32(Suppl 3): S112-119

33. Lindner A, Charra B, Sherrard DJ. Accelerated atherosclerosis in prolonged maintenance hemodialysis. N Engl J Med 1974; (290): 697-701

34. Schillaci G, Verdecchia P, Porcellati C et al. Continuous relation between left ventricular mass and cardiovascular risk in essential hypertension. Hypertension 2000; 35(2): 580-586

35. Amann K, Tornig J, Flechtenmacher C et al. Blood pressure-independent wall thickening of intramyocardial arterioles in experimental uraemia: evidence for a permissive action of PTH. Nephrol Dial Transplant 1995; 10(11): 2043-2048

36. Amann K, Ritz E. Cardiovascular abnormalities in ageing and in uraemia — only analogy or shared pathomechanisms? Nephrol Dial Transplant 1998; 13(Suppl 7): 6-11

37. Levin A, Singer J, Thompson CR et al. Prevalent left ventricular hypertrophy in the predialysis population: identifying opportunities for intervention. Am J Kidney Dis 1996; 27(3): 347-354

38. London GM. Left ventricular hypertrophy: why does it happen? Nephrol Dial Transplant 2003; 18(Suppl 8): viii 2-6

39. Murphy SW, Foley RN, Parfrey PS. Screening and treatment for cardiovasular disease in patients with chronic renal disease. Am J Kidney Dis 1998; 32(5, Suppl 3): S184-199

40. Silberberg JS, Rabal DR, Patton DR, Sniderman AD. Role of anemia in the pathogenesis of left ventricular hypertrophy in end-stage renal disease. Am J Cardiol 1989; 64(3): 222-224

41. Amann K, Rychlik I, Miltenberger-Milteny G, Ritz E. Left ventricular hypertrophy in renal failure. Kidney Int Suppl 1998; (68): S78-85

42. Horl WH, Riegel W. Cardiac depressant factors in renal disease. Circulation 1993; 87(Suppl 5): iv 77-82

43. Habib FM, Springall DR, Davies GJ et al. Tumour necrosis factor and inductible nitric oxide synthase in dilated cardiomyopathy. Lancet 1996; 347(9009): 1151-1155

44. Thaik CM, Calderone A, Takahashi N, Colucci WS. Inter-leukin-1 beta modulates the growth and phenotype of neonatal rat cardiac myocytes. J Clin Invest 1995; 96(2): 1093-1099

45. Dorairajan S, Chockalingam A, Misra M. Myocardial stunning in hemodialysis: what is the overall message? Hemodial Int 2010; 14(4): 447-450

46. Amann K, Ritz E. Cardiac structure and function in renal disease. Curr Opin Nephrol Hypertens 1996; 5(1): 102-106

47. Amann K, Ritz E. Reduced cardiac ischaemia tolerance in uraemia — What is the role of structure abnormalities of the heart. Nephrol Dial Transplant 1996; 11(7): 1238-1241

48. Tonelli M, Bohm C, Pandeya S et al. Cardiac risk factors and the use of cardioprotective medications in patients with chronic renal insufficiency. Am J Kidney Dis 2001; 37(3): 484-489

49. Sapieha P, Sirinyan M, Hamel D et al. The succinate receptor GPR 91 in neurons has a major role in retinal angiogenesis. Nat Med 2008; 14(10): 1067-1076

50. Koivunen P, Hirsilä M, Remes AM et al. Inhibition of hypoxia-inducible factor (HIF) hydroxylases by citric acid cycle intermediates: possible links between cell metabolism and stabilization of HIF. J Biol Chem 2007; 282(7): 4524-4532

51. Semenza GL. Regulation of oxygen homeostasis by hypox-ia-inducible factor 1. Physiology(Bethesda) 2009; 24(2): 97-106

52. Eddington H, Hoefield R, Sinha S et al. Serum phosphate and mortality in patients with chronic kidney disease. Clin J Am Soc Nephrol 2010; 5(12): 2251-2257

53. Kestenbaum B, Sampson JN, Rudser KD et al. Serum phosphate levels and mortality risk among people with chronic kidney disease. J Am Soc Nephrol 2005; 16(2): 520-528

54. Tonelli M, Sacks F, Pfeffer M et al. Relation between serum phosphate level and cardiovascular event rate in people with coronary disease. Circulation 2005; 112(17): 2627-2633

55. Dhingra R, Sullivan LM, Fox CS et al. Relations of serum phosphorus and calcium levels to the incidence of cardiovascular disease in the community. Arch Intern Med2007; 167(9): 879-885

56. Ganesh SK, Stack AG, Levin NW et al. Association of elevated serum PO(4), Ca x PO(4) product, and parathyroid hormone with cardiac mortality risk in chronic hemodialysis patients. J Am Soc Nephrol 2001; 12(10): 2131-2138

57. Giachelli CM. Vascular calcification: in vitro evidence for the role of inorganic phosphate. J Am Soc Nephrol 2003; 14(9, Suppl 4): S300-304

58. Jono S, Peinado C, Giachelli CM. Phosphorylation of os-teopontin is required for inhibition of vascular smooth muscle cell calcification. J Biol Chem 2000; 275(26): 20197-20203

59. Moe SM, Chen NX. Pathophysiology of vascular calcification in chronic kidney disease. Circ Res 2004; 95(6): 560-567

60. Mathew S, Tustison KS, Sugatani T et al. The mechanism of phosphorus as a cardiovascular risk factor in CKD. J Am Soc Nephrol 2008; 19(6): 1092-1105

61. Shioi A, Nishizawa Y Roles of hyperphosphatemia in vascular calcification. Clin Calcium 2009; 19(2): 180-185

62. Sage AP, Lu J, Tintut X Demer LL. Hyperphosphatemia-induced nanocrystals upregulate the expression of bone morpho-genetic protein-2 and osteopontin genes in mouse smooth muscle cells in vitro. Kidney Int 2011; 79(4): 414-422

63. Fang X Ginsberg C, Sugatami T et al. Early chronic kidney disease — mineral bone disorder stimulates vascular calcification. Kidney Int 2014; 85(1): 142-150

64. Ross R. Atherosclerosis — an inflammatory disease. N Engl J Med 1999; 340(2): 115-126

65. Toborek M, Kaiser S. Endothelial cell functions. Relationship to atherogenesis. Basic Res Cardiol 1999; 94(5): 295-314

66. Shuto E, Taketani X Tanaka R et al. Dietary phosphorus acutely impairs endothelial function. J Am Soc Nephrol 2009; 20(7): 1504-1512

67. Di Marco GS, Hausberg M, Hillebrand U et al. Increased inorganic phosphate induces human endothelial cell apoptosis in vitro. Am J Physiol Renal Physiol 2008; 294(6): 1381-1387

68. Ayus JC, Mizani MR, Achinger SG et al. Effects of short daily versus conventional hemodialysis on left ventricular hypertrophy and inflammatory markers: a prospective, controlled study. J Am Soc Nephrol 2005; 16(9): 2778-2788

69. Strozecki P, Adamowicz A, Nartowicz E et al. Parathormon, calcium, phosphorus, and left ventricular structure and function in normotensive hemodialysis patients. Ren Fail2001; 23(1): 115-126

70. Galetta F, Cupisti A, Franzoni F et al. Left ventricular function and calcium phosphate plasma levels in uraemic patients. J

Intern Med 2005; 258(4): 378-384

71. Hsu HJ, Wu MS. Fibroblast growth factor 23: a possible cause of left ventricular hypertrophy in hemodialysis patients. Am J Med Sci 2009; 337(2): 116-122

72. Marchais SJ, Metivier F, Guerin AP, London GM. Association of hyperphosphataemia with haemodynamic disturbances in end-stage renal disease. Nephrol Dial Transplant 1999; 14(9): 2178-2183

73. Neves KR, Graciolli FG, dos Reis LM et al. Adverse effects of hyperphosphatemia on myocardial hypertrophy, renal function, and bone in rats with renal failure. Kidney Int 2004; 66(6): 2237-2244

74. Смирнов АВ, Нестерова ОБ, Голубев РВ и др. Кардио-протективные эффекты сукцинатсодержащего диализирую-щего раствора. Нефрология 2012; (16)2: 69-78

75. Смирнов АВ, Нестерова ОБ, Суглобова ЕД и др. Клинико-лабораторная оценка эффективности лечения больных с терминальной стадией почечной недостаточности с использованием хронического гемодиализа и ацидосукцината. Тер арх 2013; 85(1): 69-75

76. Пизова НВ. Производные янтарной кислоты в терапии цереброваскулярных заболеваний. Неврология, нейропсихиа-трия, психосоматика 2010; (1): 67-68

77. Привалов АА, Холманских НВ, Обухов НГ, Свиридова ЛК. Применение реамберина в лечении больных с нарушениями мозгового кровообращения по ишемическому типу. Консилиум 2005; (4): 28-29

78. Румянцева СА. Комплекная антиоксидантная терапия реамберином у больных с критическими состояниями неврологического генеза. Сборник научных статей: Реамберин: реальность и перспективы. Полисан, СПб, 2002; 74-93

79. Нечипуренко НИ, Василевская ЛА, Грибоедова ТВ и др. Эффективность применения мексидола при экперимен-тальной ишемии головного мозга. Бюлл экспер биол и мед 2006; (Прилож 1): 224-229

80. Заржецкий ЮВ, Мутускина ЕА, Трубина ИЕ и др. Влияние сукцината натрия на функциональные, биохимические и морфологические показатели восстановления ЦНС у крыс после 10-минутной остановки кровообращения. Анестезиол и реаниматол 1994; (5): 96-103

81. Федин АИ, Евсеев ВН, Кузнецов ОР, Румянцева СА. Антиоксидантная терапия ишемического инсульта. Клинико-электрофизиологические корреляции. РМЖ 2009; 17(5): 332-335

82. Серегин ВИ. Применение глиатилина и мексидола в интенсивной терапии тяжелого острого ишемического инсульта. Фарматека 2006; (5): 130-133

83. Волчегорский ИА, Москвичева МГ, Чащина ЕН. Влияние эмоксипина, реамберина и мексидола на нейропа-тическую симптоматику и систолическую функцию миокарда левого желудочка у больных сахарным диабетом с синдромом диабетической стопы. Тер арх 2005; 77(10): 10-15

84. Один ВИ, Беликова ТВ, Пушкова ЕС. Сахарный диабет у пожилых: препараты янтарной кислоты в лечении диабетической нейропатии. Успехи геронтологии 2002; (9): 83-87

85. Волчегорский ИА, Москвичева МГ, Чащина ЕН. Влияние антиоксидантов на проявления сенсомоторной полиневропатии и аффективные нарушения при сахарном диабете. Клин мед 2004; (11): 31-35

86. Сухоруков ВП, Иванов СВ, Соболев АА. Реамберин как средство потенцирования лечения диабетической периферической нейропатии. Вестн СПбМА им. И.И. Мечникова 2003; (4): 131-132

87. Сухоруков ВП, Мазина НК, Иванов СВ, Соболев АА. Фармакоэкономический анализ применения реамберина в компексном лечении диабетической макроангиопатии нижних конечностей и синдрома диабетической стопы. Вестник СПбМА им. И.И. Мечникова 2005; (1): 193-194

88. Saravanan R, Pari L. Succinic acid monoethyl ester, a novel insulinotropic agent: effect on lipid composition and lipid peroxidation in streptozotocin-nicotinamide induced type 2 diabetic rats. Mol CellBiochem 2007; 296(1-2): 165-176

89. Богомолов МС, Седов ВМ, Едовина ЛМ. и др. Результаты применения цитофлавина при консервативном лечении больных с облитерирующим атеросклерозом сосудов нижних конечностей. Вестнхир 2011; 170(1): 43-46

90. Исаков ВА, Архипов ГС, Коваленко АЛ и др. Терапия вирусных инфекций. Леч врач 2000; (3): 34-36

91. Козлов ВК, Стельмах ВВ. Применение корректоров клеточного метаболизма и регуляторов энергетического обмена клеток в комплексной терапии больных хроническим вирусным гепатитом С. Мед новости 2004; (4): 5-9

92. Архипов ГС, Исаков ВА, Коваленко АЛ. Влияние реам-берина на клинико-лабораторные показатели у наркозависимых больных вирусным гепатитом. Леч врач 1999; (10): 22-25

93. Стельмах ВВ, Радченко ВГ, Козлов ВК. Метаболические корректоры на основе янтарной кислоты как средства патогенетической терапии при хронических вирусных гепатитах. Тер арх 2011; 83(2): 67-70

94. Сухоруков ВП, Мазина НК, Булдакова АВ. Фармакоэ-кономическая оценка препарата энергопротекторного типа — реамберина в послеоперационном обеспечении резекций печени. Вестн интенс тер 2005; (5): 68-69

95. Мейес П. Гликолиз и окисление пирувата. В: Марри Р, Греннер Д, Мейес П, Родуэлл В. Биохимия человека, в 2-х т.т. Мир, М., 2009; Т.1: 181-188

96. Яковлев АЮ, Бояринов ГА, Мухина ИВ и др. Коррекция метаболизма и эндотоксикоза при полиорганной дисфункции у больных перитонитом. Вестн интенс тер 1999; (5): 144-147

97. Гаин ЮМ, Алексеев СА, Шахрай СВ, Богдан ВГ. Ре-амберин в комплесном лечении больных с тяжелой интрааб-доминальной инфекцией. Вестн СПбМА им. И.И. Мечникова 2004; (2): 122-124

98. Ржеутская РЕ. Мембранотропное и дезинтоксикацион-ное действие реамберина в комплексе интенсивной терапии у больных с тяжелой внебольничной пневмонией. Вестн СПбМА им. И.И. Мечникова 2005; (2): 112-114

99. Фуфаев ЕЕ, Тулупов АН. Реамберин в комплексном лечении острых инфекционных деструкций легких. Вестн СПбМА им. И.И. Мечникова 2005; (1): 137-139

100. Галушка СВ, Назаров БФ, Власенко АВ. Применение растворов гидроксиэтилкрахмала и реамберина в комплексном лечении тяжелого гестоза. Анестезиол и реаниматол 2004; (6): 41-44

101. Салов ИА, Романовская АВ. Коррекция реологических свойств крови больных послеродовым эндометриозом. Вестник СПбМА им. Мечникова 2004; (4): 168-169

102. Володин НН, Рогаткин СО, Людовская ЕВ. Лечение детей, перенесших перинатальную гипоксию в период ранней неонатальной адаптации. Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии 2005; (1): 20-25

103. Лазарев ВВ, Михельсон ВА, Хелимская ИА и др. Первый опыт применения реамберина в анестезиологическом обеспечении новорожденных. Детская хир 2003; (6): 31-34

104. Романцов МГ. (ред.). Реамберин — инфузионный раствор для интенсивной терапии в педиатрической клинике. Полисан, СПб., 2002; 64 с

105. Аретинский ВБ, Антюфьев ВФ, Болозович АВ. Применение плазмозаменителя IV поколения реамберина в практике восстановительного лечения. Трансфузиология 2002; (4): 68-71

106. Савельев ОН, Болозович АВ, Антюфьев ВФ. Первый опыт применения базисной инфузионной терапии реамбери-ном в практике восстановительной медицины. Трансфузио-логия 2002; (4): 68-71

107. Романцов МГ, Коваленко АЛ, Рыбалкин СБ. Псориаз. Эффективность лечения реамберином. Леч врач 2000; (2): 42-44.

108. Трофимова ИБ, Костянова ЕН, Коралкин АВ. Некоторые аспекты патогенеза и лечения псориаза. Вестн дерматол и венерол 2004; (6): 33-35

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов

Поступила в редакцию: 07.02.2014 г.

Принята в печать: 29.05.2014 г.

Янтарная кислота и ее применение в медицине. Часть II. Применение янтарной кислоты в медицине | Смирнов

1. Маевский ЕИ, Гришина ЕВ, Розенфельд АСидр. Анаэробное образование сукцината и облегчение его окисления — возможные механизмы адаптации клетки к кислородному голоданию. Биомеджурн 2000; (1): 32-36

2. Белоусов ЮБ, ред. Современный подход к цитопротекторной терапии. М., 2010; 30

3. Голиков АП, Полумисков ВЮ, Михин ВП и др. Антиоксиданты — цитопротекторы в кардиологии. Кардиоваск терапия и профилактика 2004; 6(2): 66-74

4. Шляхто ЕВ, Галагудза ММ, Нифонтов ЕМ и др. Метаболизм миокарда при хронической сердечной недостаточности и современные возможности метаболической терапии. Серд недостаточность 2005; (4): 148-155

5. Олесова ВМ, Маркатюк ОЮ, Юрова ЮЮ, Обрезан АГ Метаболизм миокарда и препараты метаболического действия. Кардиология 2013; (1): 66-71

6. Stanley WC, Recchia FA, Lopaschuk GD. Myocardial substrate metabolism in the normal and failing heart. Physiol Rev 2005; 85(3): 1093-1129

7. Стаценко МЕ, Туркина СВ, Лемперт БА, Евтерева ЕД. Использование метаболических средств в комплексной терапии ишемической болезни сердца. Леч врач 2012; (3): 81-84

8. Ingwall JS. Energy metabolism in heart failure and remodelling. Cardiovasc Res 2009; 81(3): 412-419

9. Тугушева ФА, Куликова АИ, Коношкова РЛ. О влиянии предуктала-20 на ишемию миокарда и показатели липопероксидации в крови больных с хронической почечной недостаточностью, получающих регулярный гемодиализ. Нефрология 1997; 1(2): 73-78

10. Fragasso G, Perseghin G, De Cobelli F et al. Effects of metabolic modulation by trimetazidine on left ventricular function and phosphocreatine/adenosine triphosphate ratio in patients with heart failure. Eur Heart J 2006; 27(8): 942-948

11. Смирнов ЛД, Дюмаев КМ. 3-оксипроизводные шестичленных азотистых гетероциклов. Синтез, ингибирующая активность и биологические свойства. Хим-фарм журнал 1982; 16(4): 28-44

12. Лукьянова ЛД, Атабаева РЕ, Шепелева СЮ. Биоэнергетические механизмы антигипоксического действия сукцинатсодержащего производного 3-оксипиридина мексидола. Бюлл экспер биол и мед 1993; 115(3): 366-367

13. Голиков АП, Полумисков ВЮ, Михин ВП и др. Метаболический цитопротектор мексикор в терапии стабильной стенокардии напряжения. Агрокурорт 2005; 2(20): 13-20

14. Лукьянова ЛД, Романова ВЕ, Чернобаева ГН и др. Особенности антигипоксического действия мексидола, связанные с его специфическим влиянием на энергетический обмен. Хим-фарм журн 1990; 24(8): 9-11

15. Голиков АП, Михин ВП, Полумисков ВЮ и др. Эффективность цитопротектора мексикора в неотложной кардиологии. Тер арх 2004; 76(4): 60-65

16. Сыренский АВ, Галагудза ММ, Егорова ЕИ и др. Влияние изменения метаболического и антиоксидантного статуса миокарда на выраженность его ишемического и реперфузионного поражения. Рос. физиол журн им Сеченова 2008; 94(10): 1171-1180

17. Cairns CB, Ferroggiaro AA, Walther JM et al. Postishemic administration of succinate reverses the impairment of oxidative phosphorylation after cardiac ischemia and reperfusion injury. Circulation 1997; 96(Suppl.9): 260-265

18. Sakamoto M, Takeshige K, Yasui H, Tokunaga K. Cardioprotective effect of succinate against ishemia/reperfusion injury. Surg Today 1998; 28(5): 522-528

19. Хлебодаров ФЕ, Михин ВП, Мезенцева НЛ, Забелина ИВ. Влияние сочетанной терапии мексикором и ингибиторами ангиотензинпревращающего фермента на суточный профиль артериального давления и эндотелийзависимую дилатацию плечевой артерии у больных артериальной гипертензией. Мед вестн МВД 2005; 15(2): 5-8

20. Шляхто ЕВ, Трешкур ТВ, Пармон ЕВ и др. Возможности метаболической терапии у больных ишемическими желудочковыми аритмиями. Вестнаритмол 2006; (44): 5-11

21. Котляров АА, Сернов ЛН. Особенности комбинированного применения мексикора с некоторыми антиаритмическими препаратами при острой окклюзии коронарной артерии в эксперименте. Рос кардиолжурнал 2003; (5): 77-82

22. Николаев АА, Оболенский СВ, Николаев АВ. Кардиопротекторное действие поликомпонентного антигипоксанта на основе реамберина в коронарной хирургии на работающем сердце. Регион кровоснабж и микроцирк 2002; 1(2): 88-89

23. Смирнов АВ, Добронравов ВА, Каюков ИГ. Кардиоренальный континуум: патогенетические основы превентивной нефрологии. Нефрология 2005; 9(3): 7-15

24. Добронравов ВА, Жлоба АА, Трофименко ИИ. Гипергомоцистеинемия как системная проблема с точки зрения нефролога. Нефрология 2006; 10(2): 7-17

25. Смирнов АВ, Седов ВМ, Лхаахуу Од-Эрдэне и др. Снижение скорости клубочковой фильтрации как независимый фактор риска сердечно-сосудистой болезни. Нефрология 2006; 10(4): 7-17

26. Смирнов АВ, Каюков ИГ, Добронравов ВА. Концепция факторов риска в нефрологии: вопросы профилактики и лечения хронической болезни почек. Нефрология 2008; 12(1): 7-13

27. Anavekar NS, Pfeffer MA. Cardiovascular risk in chronic kidney disease. Kidney Int 2004; 66(Suppl. 92): S11-15

28. Henry RM, Kostense PJ, Bos G et al. Mild renal insufficiency is associated with increased cardiovascular mortality: the Hoorn Study. Kidney Int 2002; 62(4): 1402-1407

29. Волков ММ, Смирнов АВ, Добронравов ВА и др. Кальциноз сердечных клапанов у пациентов с хронической болезнью почек. Клин мед 2009; 87(6): 31-35

30. Смирнов АВ, Каюков ИГ, Есаян АМ и др. Превентивный подход в современной нефрологии. Нефрология 2004; 8(3): 7-14

31. Волков ММ. Биохимические показатели фосфорнокальциевого обмена у пациентов с хронической болезнью почек 1-5 стадий. Нефрология 2009; 13(3): 49-51

32. Foley RN, Parfrey PS, Sarnac MJ. Epidemiology of cardiovascular disease in chronic renal disease. Am J Kidney Dis 1998; 32(Suppl 3): S112-119

33. Lindner A, Charra B, Sherrard DJ. Accelerated atherosclerosis in prolonged maintenance hemodialysis. N Engl J Med 1974; (290): 697-701

34. Schillaci G, Verdecchia P, Porcellati C et al. Continuous relation between left ventricular mass and cardiovascular risk in essential hypertension. Hypertension 2000; 35(2): 580-586

35. Amann K, Tornig J, Flechtenmacher C et al. Blood pressure-independent wall thickening of intramyocardial arterioles in experimental uraemia: evidence for a permissive action of PTH. Nephrol Dial Transplant 1995; 10(11): 2043-2048

36. Amann K, Ritz E. Cardiovascular abnormalities in ageing and in uraemia — only analogy or shared pathomechanisms? Nephrol Dial Transplant 1998; 13(Suppl 7): 6-11

37. Levin A, Singer J, Thompson CR et al. Prevalent left ventricular hypertrophy in the predialysis population: identifying opportunities for intervention. Am J Kidney Dis 1996; 27(3): 347-354

38. London GM. Left ventricular hypertrophy: why does it happen? Nephrol Dial Transplant 2003; 18(Suppl 8): viii 2-6

39. Murphy SW, Foley RN, Parfrey PS. Screening and treatment for cardiovasular disease in patients with chronic renal disease. Am J Kidney Dis 1998; 32(5, Suppl 3): S184-199

40. Silberberg JS, Rabal DR, Patton DR, Sniderman AD. Role of anemia in the pathogenesis of left ventricular hypertrophy in end-stage renal disease. Am J Cardiol 1989; 64(3): 222-224

41. Amann K, Rychlik I, Miltenberger-Milteny G, Ritz E. Left ventricular hypertrophy in renal failure. Kidney Int Suppl 1998; (68): S78-85

42. Horl WH, Riegel W. Cardiac depressant factors in renal disease. Circulation 1993; 87(Suppl 5): iv 77-82

43. Habib FM, Springall DR, Davies GJ et al. Tumour necrosis factor and inductible nitric oxide synthase in dilated cardiomyopathy. Lancet 1996; 347(9009): 1151-1155

44. Thaik CM, Calderone A, Takahashi N, Colucci WS. Interleukin-1 beta modulates the growth and phenotype of neonatal rat cardiac myocytes. J Clin Invest 1995; 96(2): 1093-1099

45. Dorairajan S, Chockalingam A, Misra M. Myocardial stunning in hemodialysis: what is the overall message? Hemodial Int 2010; 14(4): 447-450

46. Amann K, Ritz E. Cardiac structure and function in renal disease. Curr Opin Nephrol Hypertens 1996; 5(1): 102-106

47. Amann K, Ritz E. Reduced cardiac ischaemia tolerance in uraemia — What is the role of structure abnormalities of the heart. Nephrol Dial Transplant 1996; 11(7): 1238-1241

48. Tonelli M, Bohm C, Pandeya S et al. Cardiac risk factors and the use of cardioprotective medications in patients with chronic renal insufficiency. Am J Kidney Dis 2001; 37(3): 484-489

49. Sapieha P, Sirinyan M, Hamel D et al. The succinate receptor GPR 91 in neurons has a major role in retinal angiogenesis. Nat Med 2008; 14(10): 1067-1076

50. Koivunen P, Hirsilä M, Remes AM et al. Inhibition of hypoxia-inducible factor (HIF) hydroxylases by citric acid cycle intermediates: possible links between cell metabolism and stabilization of HIF. J Biol Chem 2007; 282(7): 4524-4532

51. Semenza GL. Regulation of oxygen homeostasis by hypoxia-inducible factor 1. Physiology(Bethesda) 2009; 24(2): 97-106

52. Eddington H, Hoefield R, Sinha S et al. Serum phosphate and mortality in patients with chronic kidney disease. Clin J Am Soc Nephrol 2010; 5(12): 2251-2257

53. Kestenbaum B, Sampson JN, Rudser KD et al. Serum phosphate levels and mortality risk among people with chronic kidney disease. J Am Soc Nephrol 2005; 16(2): 520-528

54. Tonelli M, Sacks F, Pfeffer M et al. Relation between serum phosphate level and cardiovascular event rate in people with coronary disease. Circulation 2005; 112(17): 2627-2633

55. Dhingra R, Sullivan LM, Fox CS et al. Relations of serum phosphorus and calcium levels to the incidence of cardiovascular disease in the community. Arch Intern Med 2007; 167(9): 879-885

56. Ganesh SK, Stack AG, Levin NW et al. Association of elevated serum PO(4), Ca x PO(4) product, and parathyroid hormone with cardiac mortality risk in chronic hemodialysis patients. J Am Soc Nephrol 2001; 12(10): 2131-2138

57. Giachelli CM. Vascular calcification: in vitro evidence for the role of inorganic phosphate. J Am Soc Nephrol 2003; 14(9, Suppl 4): S300-304

58. Jono S, Peinado C, Giachelli CM. Phosphorylation of os-teopontin is required for inhibition of vascular smooth muscle cell calcification. J Biol Chem 2000; 275(26): 20197-20203

59. Moe SM, Chen NX. Pathophysiology of vascular calcification in chronic kidney disease. Circ Res 2004; 95(6): 560-567

60. Mathew S, Tustison KS, Sugatani T et al. The mechanism of phosphorus as a cardiovascular risk factor in CKD. J Am Soc Nephrol 2008; 19(6): 1092-1105

61. Shioi A, Nishizawa Y Roles of hyperphosphatemia in vascular calcification. Clin Calcium 2009; 19(2): 180-185

62. Sage AP, Lu J, Tintut Y Demer LL. Hyperphosphatemia-induced nanocrystals upregulate the expression of bone morphogenetic protein-2 and osteopontin genes in mouse smooth muscle cells in vitro. Kidney Int 2011; 79(4): 414-422

63. Fang Y Ginsberg C, Sugatami T et al. Early chronic kidney disease — mineral bone disorder stimulates vascular calcification. Kidney Int 2014; 85(1): 142-150

64. Ross R. Atherosclerosis — an inflammatory disease. N Engl J Med 1999; 340(2): 115-126

65. Toborek M, Kaiser S. Endothelial cell functions. Relationship to atherogenesis. Basic Res Cardiol 1999; 94(5): 295-314

66. Shuto E, Taketani X Tanaka R et al. Dietary phosphorus acutely impairs endothelial function. J Am Soc Nephrol 2009; 20(7): 1504-1512

67. Di Marco GS, Hausberg M, Hillebrand U et al. Increased inorganic phosphate induces human endothelial cell apoptosis in vitro. Am J Physiol Renal Physiol 2008; 294(6): 1381-1387

68. Ayus JC, Mizani MR, Achinger SG et al. Effects of short daily versus conventional hemodialysis on left ventricular hypertrophy and inflammatory markers: a prospective, controlled study. J Am Soc Nephrol 2005; 16(9): 2778-2788

69. Strozecki P, Adamowicz A, Nartowicz E et al. Parathormon, calcium, phosphorus, and left ventricular structure and function in normotensive hemodialysis patients. Ren Fail 2001; 23(1): 115-126

70. Galetta F, Cupisti A, Franzoni F et al. Left ventricular function and calcium phosphate plasma levels in uraemic patients. J Intern Med 2005; 258(4): 378-384

71. Hsu HJ, Wu MS. Fibroblast growth factor 23: a possible cause of left ventricular hypertrophy in hemodialysis patients. Am J Med Sci 2009; 337(2): 116-122

72. Marchais SJ, Metivier F, Guerin AP, London GM. Association of hyperphosphataemia with haemodynamic disturbances in end-stage renal disease. Nephrol Dial Transplant 1999; 14(9): 2178-2183

73. Neves KR, Graciolli FG, dos Reis LM et al. Adverse effects of hyperphosphatemia on myocardial hypertrophy, renal function, and bone in rats with renal failure. Kidney Int 2004; 66(6): 2237-2244

74. Смирнов АВ, Нестерова ОБ, Голубев РВ и др. Кардиопротективные эффекты сукцинатсодержащего диализирующего раствора. Нефрология 2012; (16)2: 69-78

75. Смирнов АВ, Нестерова ОБ, Суглобова ЕД и др. Клинико-лабораторная оценка эффективности лечения больных с терминальной стадией почечной недостаточности с использованием хронического гемодиализа и ацидосукцината. Тер арх 2013; 85(1): 69-75

76. Пизова НВ. Производные янтарной кислоты в терапии цереброваскулярных заболеваний. Неврология, нейропсихиатрия, психосоматика 2010; (1): 67-68

77. Привалов АА, Холманских НВ, Обухов НГ, Свиридова ЛК. Применение реамберина в лечении больных с нарушениями мозгового кровообращения по ишемическому типу. Консилиум 2005; (4): 28-29

78. Румянцева СА. Комплекная антиоксидантная терапия реамберином у больных с критическими состояниями неврологического генеза. Сборник научных статей: Реамберин: реальность и перспективы. Полисан, СПб, 2002; 74-93

79. Нечипуренко НИ, Василевская ЛА, Грибоедова ТВ и др. Эффективность применения мексидола при экпериментальной ишемии головного мозга. Бюлл экспер биол и мед 2006; (Прилож 1): 224-229

80. Заржецкий ЮВ, Мутускина ЕА, Трубина ИЕ и др. Влияние сукцината натрия на функциональные, биохимические и морфологические показатели восстановления ЦНС у крыс после 10-минутной остановки кровообращения. Анестезиол и реаниматол 1994; (5): 96-103

81. Федин АИ, Евсеев ВН, Кузнецов ОР, Румянцева СА. Антиоксидантная терапия ишемического инсульта. Клиникоэлектрофизиологические корреляции. РМЖ 2009; 17(5): 332-335

82. Серегин ВИ. Применение глиатилина и мексидола в интенсивной терапии тяжелого острого ишемического инсульта. Фарматека 2006; (5): 130-133

83. Волчегорский ИА, Москвичева МГ, Чащина ЕН. Влияние эмоксипина, реамберина и мексидола на нейропатическую симптоматику и систолическую функцию миокарда левого желудочка у больных сахарным диабетом с синдромом диабетической стопы. Тер арх 2005; 77(10): 10-15

84. Один ВИ, Беликова ТВ, Пушкова ЕС. Сахарный диабет у пожилых: препараты янтарной кислоты в лечении диабетической нейропатии. Успехи геронтологии 2002; (9): 83-87

85. Волчегорский ИА, Москвичева МГ, Чащина ЕН. Влияние антиоксидантов на проявления сенсомоторной полиневропатии и аффективные нарушения при сахарном диабете. Клин мед 2004; (11): 31-35

86. Сухоруков ВП, Иванов СВ, Соболев АА. Реамберин как средство потенцирования лечения диабетической периферической нейропатии. Вестн СПбМА им. И.И. Мечникова 2003; (4): 131-132

87. Сухоруков ВП, Мазина НК, Иванов СВ, Соболев АА. Фармакоэкономический анализ применения реамберина в компексном лечении диабетической макроангиопатии нижних конечностей и синдрома диабетической стопы. Вестник СПбМА им. И.И. Мечникова 2005; (1): 193-194

88. Saravanan R, Pari L. Succinic acid monoethyl ester, a novel insulinotropic agent: effect on lipid composition and lipid peroxidation in streptozotocin-nicotinamide induced type 2 diabetic rats. Mol CellBiochem 2007; 296(1-2): 165-176

89. Богомолов МС, Седов ВМ, Едовина ЛМ. и др. Результаты применения цитофлавина при консервативном лечении больных с облитерирующим атеросклерозом сосудов нижних конечностей. Вестнхир 2011; 170(1): 43-46

90. Исаков ВА, Архипов ГС, Коваленко АЛ и др. Терапия вирусных инфекций. Леч врач 2000; (3): 34-36

91. Козлов ВК, Стельмах ВВ. Применение корректоров клеточного метаболизма и регуляторов энергетического обмена клеток в комплексной терапии больных хроническим вирусным гепатитом С. Мед новости 2004; (4): 5-9

92. Архипов ГС, Исаков ВА, Коваленко АЛ. Влияние реамберина на клинико-лабораторные показатели у наркозависимых больных вирусным гепатитом. Леч врач 1999; (10): 22-25

93. Стельмах ВВ, Радченко ВГ, Козлов ВК. Метаболические корректоры на основе янтарной кислоты как средства патогенетической терапии при хронических вирусных гепатитах. Тер арх 2011; 83(2): 67-70

94. Сухоруков ВП, Мазина НК, Булдакова АВ. Фармакоэкономическая оценка препарата энергопротекторного типа — реамберина в послеоперационном обеспечении резекций печени. Вестн интенс тер 2005; (5): 68-69

95. Мейес П. Гликолиз и окисление пирувата. В: Марри Р, Греннер Д, Мейес П, Родуэлл В. Биохимия человека, в 2-х т.т. Мир, М., 2009; Т.1: 181-188

96. Яковлев АЮ, Бояринов ГА, Мухина ИВ и др. Коррекция метаболизма и эндотоксикоза при полиорганной дисфункции у больных перитонитом. Вестн интенс тер 1999; (5): 144-147

97. Гаин ЮМ, Алексеев СА, Шахрай СВ, Богдан ВГ. Реамберин в комплесном лечении больных с тяжелой интраабдоминальной инфекцией. Вестн СПбМА им. И.И. Мечникова 2004; (2): 122-124

98. Ржеутская РЕ. Мембранотропное и дезинтоксикационное действие реамберина в комплексе интенсивной терапии у больных с тяжелой внебольничной пневмонией. Вестн СПбМА им. И.И. Мечникова 2005; (2): 112-114

99. Фуфаев ЕЕ, Тулупов АН. Реамберин в комплексном лечении острых инфекционных деструкций легких. Вестн СПбМА им. И.И. Мечникова 2005; (1): 137-139

100. Галушка СВ, Назаров БФ, Власенко АВ. Применение растворов гидроксиэтилкрахмала и реамберина в комплексном лечении тяжелого гестоза. Анестезиол и реаниматол 2004; (6): 41-44

101. Салов ИА, Романовская АВ. Коррекция реологических свойств крови больных послеродовым эндометриозом. Вестник СПбМА им. Мечникова 2004; (4): 168-169

102. Володин НН, Рогаткин СО, Людовская ЕВ. Лечение детей, перенесших перинатальную гипоксию в период ранней неонатальной адаптации. Вопросы гинекологии, акушерства и перинатологии 2005; (1): 20-25

103. Лазарев ВВ, Михельсон ВА, Хелимская ИА и др. Первый опыт применения реамберина в анестезиологическом обеспечении новорожденных. Детская хир 2003; (6): 31-34

104. Романцов МГ. (ред.). Реамберин — инфузионный раствор для интенсивной терапии в педиатрической клинике. Полисан, СПб., 2002; 64 с

105. Аретинский ВБ, Антюфьев ВФ, Болозович АВ. Применение плазмозаменителя IV поколения реамберина в практике восстановительного лечения. Трансфузиология 2002; (4): 68-71

106. Савельев ОН, Болозович АВ, Антюфьев ВФ. Первый опыт применения базисной инфузионной терапии реамберином в практике восстановительной медицины. Трансфузиология 2002; (4): 68-71

107. Романцов МГ, Коваленко АЛ, Рыбалкин СБ. Псориаз. Эффективность лечения реамберином. Леч врач 2000; (2): 42-44.

108. Трофимова ИБ, Костянова ЕН, Коралкин АВ. Некоторые аспекты патогенеза и лечения псориаза. Вестн дерматол и венерол 2004; (6): 33-35

что, для чего нужна / Лазерный Доктор СПб

Янтарная кислота давно известна своими полезными качествами. Так, вещество встречается не только в организмах животных, но и в растениях. Янтарная кислота является регулятором процессов, которые происходят в живых организмах. В частности, она является важным компонентов в процессе обмена веществ.

Поэтому ничего удивительного в том, что сегодня это вещество активно применяется врачами. В этой статье мы расскажем, что такое янтарная кислота, для чего она нужна и как применяется.

Что такое янтарная кислота

Янтарную кислоту по праву можно назвать важным биохимическим веществом. Кстати, она может и по-другому называться: например, бутандиовая кислота, сукцинат натрия. Издавна это вещество применяется в качестве антибиотика или болеутоляющего. Однако чем полезна янтарная кислота для кожи?

Положительные свойства янтарной кислоты

Сукцинат натрия оказывает положительное воздействие не только на внутренние ткани, но и на кожу человека. Во-первых, он улучшает функционирование сальных желез. Именно поэтому, кстати, это вещество часто добавляют в состав различных тоников и масок. Во-вторых, кислота янтарная отлично выводит токсины из тканей. В-третьих, это вещество оказывает положительное воздействие на иммунную систему, поддерживая и укрепляя ее. В-четвертых, оно оказывает и противовоспалительный эффект на ткани кожи. Именно благодаря этим положительным свойствам янтарной кислоты на кожу, она получила широкое распространение в косметологии.

Применение янтарной кислоты

В косметологии янтарная кислота применяется, например, в составе масок, кремов, тоников. Кроме того, это вещество также входит в состав инъекционных препаратов. Применение янтарной кислоты в современной косметологии позволяет добиться следующих результатов:

1. Повышение эластичности кожи.

2. Очищение кожных покровов.

3. Стимуляция кровообращения.

4. Борьба с первыми проявлениями старения.

5. Повышение тонуса кожи.

6. Коррекция тона лица.

7. Борьба с отечностью и мешками под глазами.

8. Устранение акне.

Отмечается, что при этом янтарная кислота и для мужчин, и для женщин эффективна в одинаковой степени.

Янтарная кислота в редермализации

Сегодня одной из самых востребованных косметологических процедур с применением янтарной кислоты является редермализация. Это инъекционная процедура. Это значит, что средство доставляется в глубокие слои кожи путем множества микроинъекций.

Препараты для редермализации состоят из смеси гиалуроновой и янтарной кислот (подробнее о препаратах Гиалуаль). Такое сочетание позволяет эффективно увлажнить кожу, разгладить морщинки, выровнять цвет и рельеф лица. Кроме того, редермализация отлично подходит для подготовки к ряду аппаратных, лазерных и инъекционных процедур. Также редермализация, проведенная после этих процедур, поможет улучшить и закрепить полученный результат, будет способствовать более быстрому восстановлению кожи.

Редермализация кожи не требует от пациента какой-то особой подготовки. Но проводится она, как правило, после консультации специалиста. Если он не выявит противопоказаний, то сеанс может быть проведен сразу по окончании консультации. Процедура проводится после обработки кожи анестетиком. Благодаря этому пациент не испытывает сильных дискомфортных ощущений. Время процедуры составляет около 45 минут. Но и этого достаточно, чтобы увидеть результаты даже после первого сеанса.

Теперь, когда вы знаете, для чего нужна янтарная кислота, вы можете смело записываться на процедуры с ее использованием. В частности, в нашей клинике вы можете записаться на процедуру редермализации кожи как лица, так и тела.

её применение для растений, способы и советы

Комнатные растения есть практически в каждом доме или квартире. Они придают уюта жилищу, благоприятно влияют на микроклимат. Но для того чтобы зелёные питомцы каждый день радовали глаз, им необходимо создавать благоприятные условия для роста и цветения. Помощь в этом может оказать янтарная кислота, использовать которую не составит труда даже начинающему цветоводу.

Но чтобы её применение было более эффективным, для начала необходимо разобраться в свойствах и особенностях применения такого вещества.

Что такое янтарная кислота?

Янтарная кислота (по научному, этан-1,2 – дикарбоновая кислота), представляет собой бесцветные кристаллы, прекрасно растворяющиеся как в спирте, так и в воде. Не обладает никаким запахом.

В природных условиях её можно найти повсюду, в малых количествах она входит в химический состав растений и животных, её вырабатывает человеческий организм, присутствует в янтаре и буром угле, а для её промышленного производства применяют специальную обработку малеинового ангидрида.

Данное вещество можно приобрести в виде порошка и в таблетках.

Свойства янтарной кислоты

К основным свойствам этого вещества, которые и стали причиной столь широкого его применения, можно отнести:

• Не вызывает загрязнения окружающей среды, благодаря своей хорошей естественной утилизации;
• Нормализует жизнедеятельность полезных почвенных микроорганизмов;
• Способствует разрушению токсичных веществ в почве;
• Является биостимулятором широкого спектра действия.
• Воздействие янтарной кислоты на комнатные растения

Прежде всего, следует отметить, что янтарную кислоту нельзя назвать удобрением для растений. Она стимулятор для многих процессов в ходе роста и отличный адаптоген.

Она способствует:

• Повышению иммунитета растения, благодаря чему оно становится более устойчивым к агрессивным факторам окружающей среды и болезням;
• Активизации обмена веществ, что, в свою очередь, ускоряет рост и не даёт возможности накопления нитратов и других вредных соединений в тканях растения;
• Процессу корнеобразования, что особенно важно для черенков или только пересаженных саженцев;
• Усвоению всего спектра удобрений;
• Увеличению количества хлорофилла в листьях;
• Восстановлению растения после стресса (ошибки в уходе, сильное повреждение болезнями или вредителями, пересыхание или переувлажнение, пересадка и прочее).

К тому же янтарная кислота не накапливается ни в самих растениях, ни в почве.

Способы применения

Правильно применяя янтарную кислоту можно значительно улучшить условия для роста растений. Рекомендации к применению отличаются в зависимости от способа применения.

Применение янтарной кислоты в таблетках

Янтарная кислота, которая выпускается в таблетках, самая удобная форма промышленного выпуска этого препарата. Способы применения зависят от конкретных задач.

Применение янтарной кислоты в таблетках для стимуляции корневой системы

Хорошего результата можно достичь, если использовать янтарную кислоту для стимуляции роста корневой системы растений. Для начала, требуется правильно изготовить раствор из таблеток. Для этого потребуется взять 3 таблетки и залить их литром воды. Должен получиться не слишком концентрированный раствор, который растениям не навредит.

От более концентрированного раствора положительного результата не получится.

Далее, следует поступать в зависимости от того, необходимо ухаживать за уже взрослым экземпляром или за молодым саженцем.

В первом случае данное вещество вносят непосредственно под корни до тех пор, пока почва, в районе корневой системы, не пропитается полностью. Повторять внесение препарата требуется раз в неделю, пока общее состояние растения не начнёт улучшаться. Тогда можно переходить и к другим агротехническим методам ухода.

Растения, приготовленные к посадке, замачивают максимум на 1 час. В данном случае использование янтарной кислоты в таблетках оказывает значительную поддержку молодому растению, как следствие, в дальнейшем оно будет гораздо лучше развиваться.

Отзыв:

Применяла янтарную кислоту для кактусов и суккулентов. Я и не ожидала от них сильных изменений, но очень удивилась, когда в течение месяца моя хавортия образовала одновременно 10 деток.

Но повторно вносить это вещество кактусам и суккулентам я бы не советовала: получается обратная реакция. Применяю не чаще, чем один раз на протяжении двух лет.

Ольга

Использование таблеток янтарной кислоты для стеблей

Когда требуется укрепить стебли или стимулировать растение к появлению новых побегов, требуется изготовить менее концентрированный раствор, чем для корневой системы. При каком способе применения хватит одной таблетки на литр воды.

Стебли растений обрабатывают готовым раствором методом опрыскивания. Поэтому потребуется приобрести распылитель. Наносят раствор на все части вегетирующего растения, которые располагаются выше уровня земли. Обрабатываются листья, побеги и ствол.

Также применяется янтарная кислота в таблетках, когда растение было сильно повреждено. К примеру, было обморожено или сильно пересушено. Благодаря такой обработке удастся ускорить восстановление цветка.

Это вещество применяется и при укоренении черенков. Обработка черенков производится раствором 0,02%. Срезы черенков погружают на 2 см в жидкий раствор препарата и оставляют на 2-3 часа.

Отзыв:

Использую янтарку для полива рассады, в пропорции 1 таблетка на два литра обычной водопроводной воды. Сначала растворяю таблетку в небольшом количестве хорошо тёплой воды, потом добавляю холодную, до необходимого объёма.

Поливаю примерно раз в неделю. Растения, по сравнению с необработанными, быстрее растут и становятся менее чувствительными к холоду.

Но есть и негативный момент, при длительном использовании янтарки, она начинает окислять почву, что понравится не всем растениям. Поэтому приходится возвращать кислотность почвы в норму всеми способами.

Николай

Применение янтарной кислоты для орхидей

Янтарная кислота оказывает укрепляющее и стимулирующее действие. Цветы, которые приостановились в росте, после применения янтарки начинают более активно увеличивать зелёную массу, образовывать новые корни.

Непосредственно для орхидей, янтарная кислота полезна для активного корнеобразования — это самый проблемный момент у этих растений, особенно купленных в магазине. После применения этого препарата орхидеи более активно образуют новые, здоровые корни, растения лучше приживаются.

Для стимуляции формирования корней одну таблетку янтарной кислоты растворяют в 500 мл дистиллированной воды. Если, имеющаяся в наличии, янтарная кислота в виде порошка, то берётся объем на кончике ножа. Из пульверизатора этим раствором тщательно обрабатывают нижние листья орхидеи, корневую шейку, а оставшимся раствором поливают почву. Чтобы вещество точно достигло цели, имеет смысл замочить ёмкость с орхидеей в растворе — так же как и при погружном поливе. Почва хорошо пропитается, и янтарная кислота будет действовать более длительный срок.

Важно, в каких дозировках готовить янтарную кислоту для орхидей, чтобы стимулировать развитие растения. Хотя можно отметить, что случаев повреждения растений от передозировки этого вещества ещё не фиксировалось. Но во всём необходима мера, чтобы достичь необходимых результатов.

Отзыв:

Применял янтарку для укоренения орхидей. Эффект был средним. По сравнению с контрольными черенками, которые не обрабатывал, укореняемость выросла процентов на 30-35.

Ещё заметил, что готовый раствор янтарной кислоты очень быстро теряет свои свойства, не через сутки, как обычно пишут, а часов через 10-12.

Игорь Лихолесов

Хранение

Хранить препарат в не разведённом виде требуется в тёмном сухом месте, при температуре не свыше 25 градусов.

Приготовленный раствор сохраняет свои свойства не более, чем 3-5 суток.

Меры предосторожности

Этот препарат не относится к токсичным для человека и животных и не вызывает загрязнения окружающей среды. Но растворы значительных концентраций, при попадании в глаза или желудок, зачастую вызывают воспаление слизистых оболочек. Если произошло попадание концентрированного препарата в глаза или желудок, их сразу следует промыть значительным количеством воды. После этого незамедлительно обратиться к врачу.

Препарат должен храниться быть вне досягаемости детей и животных, а также не находиться вблизи продуктов питания и лекарств.

Заключение

Как следует из вышеизложенного, применение янтарной кислоты для комнатных растений приносит хорошие результаты. Кроме того, это вещество прекрасно сочетается со всем спектром удобрений и химикатов для комнатных цветов.

Янтарная кислота для цветов является своеобразным реаниматором, который помогает растению перенести неблагоприятные внешние условия.

И как следствие, ваш любимый цветок всегда будет радовать красотой и здоровьем.

Оцените статью: Поделитесь с друзьями!

Янтарная кислота — обзор

Янтарная кислота, 1,4-бутандиол и полибутиленсукцинат (PBS)

Мономер янтарной кислоты может быть получен с помощью микробной ферментации или синтетических химических процедур. Химический синтез хорошо описан в литературе (Chen and Patel, 2012), а также электрохимический процесс, новая процедура, принятая для пищевых и фармацевтических применений, которая является многообещающей технологией благодаря высокому выходу, низкой стоимости и высокой чистоте мономеров. , без отходов производства.

Для производства микробов в промышленности можно использовать несколько микроорганизмов, например Actinobacillus succinogenes , Anaerobiospirillum succiniciproducens и Mannheimia succiniciproducens (Chen and Patecel, 2012), из кукурузного крахмала , или лигноцеллюлозы в качестве биологического сырья. Во время ферментации могут образовываться различные побочные продукты, такие как ацетат и формиат, снижающие концентрацию янтарной кислоты.Более того, к сожалению, производственные затраты на последующее производство все еще слишком высоки, составляя 60% -70% от общих затрат на производство янтарной кислоты. Улучшения для низкозатратных процессов, а также для процессов очистки изучаются с целью оптимизации производства янтарной кислоты. Несколько глобальных компаний, включая BASF, Purac, BioAmber, Myriant, Amyris и Mitsubishi Chemical Corporation, работают над микробиологическим производством янтарной кислоты. 1,4-бутандиол в настоящее время получают из нефтехимических ресурсов с помощью химического процесса.Существует большой интерес к микробному производству 1,4-бутандиола на биологической основе из сахарозы в качестве возобновляемого ресурса или путем каталитического водно-фазового гидрирования янтарной кислоты на основе биомассы, как сообщили Чен и Патель (2012).

Поли (бутиленсукцинат) (PBS) впервые был получен путем переэтерификации и поликонденсации. Стехиометрические количества диметилсукцината и 1,4-бутандиола или с избытком не более 10% 1,4-бутандиола в присутствии тетра- n -бутилтитаната или тетраизопропилтитаната в качестве катализаторов, полимеризовали в расплаве при интенсивном перемешивании при 150–190 ° C в атмосфере азота во избежание окисления.После удаления метанола, поступающего из реакции переэтерификации, поликонденсацию проводят при 200 ° C под вакуумом, чтобы удалить избыток бутандиола, полимеризовать олигомеры и увеличить молекулярную массу до M _n 60000 и M _w 100000. Полимеризация в расплаве предпочтительна для упаковки пищевых продуктов, поскольку в ней отсутствуют растворители.

Для увеличения молекулярной массы PBS можно использовать удлинитель цепи для соединения двух цепей PBS с концевыми группами OH или COOH.Для упаковочных материалов, контактирующих с пищевыми продуктами, это не допускается, чтобы гарантировать характеристики биобезопасности и биоразлагаемости.

В целом, PBS имеет температуру плавления от 112 ° C до 116 ° C, температуру стеклования от -33 ° C до -37 ° C, температуру разложения около 353 ° C, модуль Юнга около 268 МПа, удлинение при разрыве около 175% и предел прочности на разрыв около 25 МПа. Благодаря этим свойствам он подходит для нескольких применений.

Он разлагается при гидролизе сложноэфирных связей с уменьшением молекулярной массы, что делает возможной последующую микробную деградацию.Недавно в нескольких статьях сообщалось о характеристиках таких полимеров, особенно в отношении их газонепроницаемости при упаковке пищевых продуктов. Например, Siracusa et al. (2015) изучали PBS и сополимер с полибутиленадипатом (PBS-PBA) после имитаторов контакта с пищевыми продуктами, фото- и термоокислительной деструкции. Барьерные свойства пленок сополимеров PBS и PBS- co -PBA были протестированы с различными газами (кислородом и углекислым газом) при разных температурах (от 5 ° C до 40 ° C), чтобы понять влияние температуры на проницаемость. поведения, чтобы вычислить энергию активации процесса и установить отношения, связывающие коэффициенты диффузии (D) и растворимость (S) с температурой.Кроме того, образцы были охарактеризованы с термической точки зрения, чтобы установить корреляцию между проницаемостью и структурой / кристалличностью образца. Хотя была обнаружена структурная стабильность полимеров в условиях процесса, поведение газового барьера в основном зависело от условий процесса, которые в основном зависели от нескольких физико-химических факторов.

Янтарная кислота во многих медицинских целях

Многие люди не знают о невероятном влиянии янтарной кислоты на наш организм.Он участвует в нескольких химических процессах, которые в основном связаны с нашим метаболизмом. Это древнее лекарство, которое использовалось на протяжении тысячелетий. Наибольшее количество янтарной кислоты содержится в балтийском янтаре, который добывают в странах Балтии.

Природа дала человечеству множество решений для лечения различных заболеваний. С увеличением использования фармацевтических препаратов и постоянно растущим списком вредных побочных эффектов лекарств янтарная кислота является естественным решением проблем, связанных с болью.

Янтарная кислота также содержится в тканях животных и растений во всем мире. Для фармацевтического или домашнего использования его либо извлекают из янтаря, либо производят синтетическим путем. Слово « янтарный, » на латыни означает «сукцинум», что означает «янтарный».

Наши предки использовали янтарь в медицине на протяжении тысячелетий. Хотя они не знают химического состава янтаря, они высоко ценили драгоценный камень из-за его целебных свойств.Вот почему древние знахари и целители рекомендовали своим пациентам жевать янтарь или носить его в качестве ожерелья для лечения болезней.

Обладая современным пониманием его свойств, мы извлекли необходимые химические вещества и произвели лекарства, которые используются для лечения различных заболеваний, некоторые из которых упомянуты ниже.

Янтарная кислота обладает особыми свойствами, снимающими стресс и беспокойство. Стресс считается основной причиной различных психических и физических проблем со здоровьем.Кислота направлена ​​на устранение первопричин стресса, стимулируя ваш мозг и «заставляя» его нормально функционировать.

Улучшает клеточное дыхание

Недавние исследования показали способность янтарной кислоты улучшать клеточное дыхание, а также метаболизм глюкозы, что позволяет организму функционировать оптимально. Когда клетки могут принимать кислород и использовать его для производства энергии, у нашего тела есть энергия, необходимая для того, чтобы оставаться в форме и быть здоровым все время.

Предотвращает простуду

До того, как эти целебные свойства были полностью известны, использование янтаря было окружено множеством суеверий. Люди верили, что балтийский янтарь (янтарная кислота) может отгонять злых духов, вызывающих простуду или грипп. Это суеверие оказалось правдой, поскольку янтарная кислота действительно помогает укрепить иммунную систему, что, в свою очередь, снижает риск заболевания простудой или гриппом.

Облегчение при прорезывании зубов у младенцев

Возможно, одним из самых больших преимуществ янтарной кислоты является то, что она используется для облегчения симптомов колик у младенцев, прорезывающих зубы.Младенцы постоянно испытывают боль при прорезывании зубов. Если янтарь используется в форме ожерелья, янтарная кислота выделяется при ношении ожерелья близко к коже ребенка. Затем кислота впитывается в кожу ребенка, оказывая успокаивающее действие.

Используется для лечения артрита

Хотя название говорит о другом, янтарная кислота на самом деле обладает противовоспалительным действием и содержит много антиоксидантов. Обладая различными свойствами, облегчающими боль, многие пациенты носят янтарь на запястьях или пораженной области для эффективного обезболивания.

Воздействие на сердце

Янтарная кислота регулирует кардиомиоциты. Это означает, что он помогает сердцу правильно перекачивать кровь. Это хорошо для людей, страдающих сердечно-сосудистыми заболеваниями. Янтарная кислота даже помогает предотвратить сердечные приступы.

Очищает разум от негатива и успокаивает

Янтарная кислота оказывает важное влияние на наш разум. Текущие мировые проблемы и даже повседневные ссоры могут вызвать у вас сильный стресс, что плохо сказывается на вашем здоровье в целом.Поскольку янтарная кислота помогает снять стресс и накопление химикатов, вы испытываете чувство блаженства, надевая балтийский янтарь.

Снятие стресса важно, потому что, успокоившись, вы можете сосредоточиться на том, что важно в вашей жизни. Регулярная практика снятия стресса может привести к тому, что вы сможете легче справляться со стрессовыми ситуациями в долгосрочной перспективе.

Янтарная кислота имеет бесчисленные преимущества для человеческого организма, которые теперь признаны наукой и используются медицинскими учреждениями.Природные очищающие свойства кислоты оказались интригующими, поскольку, как говорят, она способна делать все, начиная от устранения накопления отрицательной энергии и облегчения хронической боли.

Многие мистики носят балтийский янтарь, чтобы успокоить свой ум и избавиться от любой негативной энергии, как способ улучшить свою концентрацию во время медитации. Янтарная кислота, содержащаяся в балтийском янтаре, вызывает у пользователей теплое чувство, когда они начинают подавлять свои желания и становятся единым целым со вселенной.

С учетом сказанного, ношение балтийского янтаря позволяет янтарной кислоте проникать в ваше тело на долгое время, поэтому многие духовные гуру носят бусы из янтаря.

По сей день многие люди разрешают носить янтарь младенцам из-за его множества защитных и лечебных свойств. Доказано, что дети, употребляющие янтарную кислоту, более счастливы и спокойнее в сложных ситуациях, что еще раз подчеркивает ее действенность.

Обезболивающие свойства делают янтарную кислоту отличным средством от многих недугов. Снижая раздражительность и предотвращая менопаузу, янтарная кислота веками играла ключевую роль в исцелении и облегчении боли для многих людей.

Хотя янтарная кислота немного изучена наукой, многие считают, что еще многое об этом свойстве нам неизвестно. В конце концов, у природы есть множество чудес медицины, которые еще не нашли объяснения.

Надеюсь, что однажды человечество сможет продолжить свой анализ этого лекарства и углубить понимание того, как его можно использовать к лучшему. А до тех пор вы можете продолжать получать пользу от различных применений янтарной кислоты и многочисленных способов, с помощью которых она может помочь вам улучшить свое здоровье.Однако сначала обязательно проконсультируйтесь с врачом.

Янтарная кислота • Потенциально НАХОДИТСЯ в продуктах питания, почве, воде, пыли, компосте, волосах, косметике, лекарствах, животных и домашних животных, дома или на рабочем месте • ВЛИЯНИЕ НА ЗДОРОВЬЕ • следует ли Я ИЗБЕГАТЬ его • тестирование с помощью TOXTEST в Австралии • вещество_id_1597 • CASRN : 110-15-6

Атрибуты вещества

• Вмешательство или нарушение обмена веществ

  Влияет на метаболизм человека. Это может быть очень серьезным делом.Некоторые из этих механизмов интерференции хорошо известны. Однако часто долгосрочные эффекты и последствия для здоровья остаются в значительной степени неизвестными. Кроме того, возникает проблема, которая в настоящее время не изучается, — это комбинированные синергические эффекты, которые эти химические вещества, нарушающие метаболизм, оказывают на здоровье человека.

  Метаболическое вмешательство происходит, когда вещество производит высокореактивные и часто повреждающие промежуточные продукты во время детоксикации, или когда вещество связывается со специфическими ферментами, важными структурными группами на молекулах, рецепторах и мембранах, нацеливается на ДНК или имитирует ключевые питательные вещества.

• Воздействие вызывает симптомы для здоровья

  Симптомы могут быть краткосрочными или долгосрочными в зависимости от продолжительности и интенсивности воздействия, а также областей воздействия, таких как сердечно-сосудистая система, желудочно-кишечный тракт, когнитивные функции, усталость. Вещество с этим атрибутом может вызвать аллергическую кожную реакцию, серьезное раздражение глаз, симптомы аллергии или астмы или затруднение дыхания при вдыхании.

• Известны побочные эффекты

  Это часто является результатом длительного или краткосрочного использования лекарств.Одно и то же лекарство может иметь ряд побочных эффектов, от полного отсутствия до полностью изнурительных симптомов у разных людей. Причины этого включают индивидуальную генетику, индивидуальную способность к детоксикации, статус питания, продолжительность приема и общее количество принимаемых лекарств.

  При одновременном приеме нескольких лекарств очень трудно установить четкие причины симптомов.

  См. ССЫЛКУ НА ПОБОЧНЫЕ ЭФФЕКТЫ в конце этого профиля.

Эти атрибуты основаны ТОЛЬКО на данных, прошедших экспертную оценку.См. Ссылку на источники данных ниже. Всем выгодно знать это. Поделись, пожалуйста.

Tweet

---

• КАТЕГОРИИ: Пищевые добавки с номерами E | Кислота, регуляторы кислотности, агенты, препятствующие слеживанию, противовспенивающие агенты, наполнители, носители и растворители-носители, эмульгирующие соли, укрепляющие агенты, усилители вкуса, агенты для обработки муки, пенообразователи, глазирующие агенты, увлажнители, модифицированные крахмалы, упаковочные газы, пропелленты, разрыхлители и секвестранты.| Лекарства или наркотики | Пищевой токсин | Натуральный токсин | Токсин животных | EAFUS (все, что добавлено в пищу в Соединенных Штатах) | Инертный пестицидный ингредиент США — только непищевое использование
• ВЕЩЕСТВА: Органические соединения | Органические кислоты и производные | Карбоновые кислоты и производные | Дикарбоновые кислоты и производные | Дикарбоновые кислоты и производные
• СИНОНИМЫ: 1,2-этандикарбоксилат | 1,2-этандикарбоновая кислота | 1,4-бутандиоат | 1,4-бутандиовая кислота | Бутандиовая кислота | Acide succinique | Янтарная кислота | Янтарная кислота | Asuccin | Bernsteinsaeure | Bernsteinsaure | Бутандизар | Бутандиовая кислота | Бутандионовая кислота | Дигидрофумарат | Дигидрофумаровая кислота | e363 | Этилен янтарная кислота | HOOC-Ch3-Ch3-COOH | Катасучин | Дух янтаря | Сукцинат | Кислота полынная
• ОПИСАНИЕ: E Номер: E363 | Пищевые добавки с номерами E используются в Австралии, Новой Зеландии, Великобритании и ЕС.Всего более 400. | Вещество было одобрено в Австралии и Новой Зеландии | ЕС и Великобритания | | Кислота, регуляторы кислотности, агенты, препятствующие слеживанию, противовспенивающие агенты, наполнители, носители и растворители-носители, эмульгирующие соли, укрепляющие агенты, усилители вкуса, агенты для обработки муки, пенообразователи, глазирующие агенты, увлажнители, модифицированные крахмалы, упаковочные газы, пропелленты, разрыхлители и секвестранты. | Янтарная кислота — дикарбоновая кислота. Анион, сукцинат, является компонентом цикла лимонной кислоты, способным отдавать электроны цепи переноса электронов.Янтарная кислота образуется как побочный продукт ферментации сахара. Он придает сброженным напиткам, таким как вино и пиво, общий вкус, который представляет собой сочетание солености, горечи и кислотности. Сукцинат обычно используется в качестве промежуточного химического вещества в медицине, производстве лаков и для изготовления сложных эфиров духов. Он также используется в пищевых продуктах как секвестрант, буфер и нейтрализующий агент. Сукцинат играет роль в цикле лимонной кислоты, процессе выработки энергии, и метаболизируется сукцинатдегидрогеназой до фумарата.Сукцинатдегидрогеназа (SDH) играет важную роль в митохондриях, будучи одновременно частью дыхательной цепи и цикла Кребса. SDH с ковалентно присоединенной простетической группой FAD связывает ферментные субстраты (сукцинат и фумарат) и физиологические регуляторы (оксалоацетат и АТФ). Окисляющий сукцинат связывает SDH с частью цикла Кребса с быстрым циклом, где он участвует в расщеплении ацетил-КоА на протяжении всего цикла Кребса. Сукцинат можно легко импортировать в матрицу митохондрий с помощью дикарбоксилатного носителя, чувствительного к н-бутилмалонату (или фенилсукцинату), в обмен на неорганический фосфат или другую органическую кислоту, например.грамм. малат. (A3509) Мутации в четырех генах, кодирующих субъединицы сукцинатдегидрогеназы, связаны с широким спектром клинических проявлений (например, с болезнью Хантингтона. (A3510). Сукцинат также действует как онкометаболит. Сукцинат ингибирует 2-оксоглутарат-зависимый гистон и ДНК ферменты деметилазы, приводящие к эпигенетическому молчанию, влияющему на нейроэндокринную дифференцировку.9
• КОММЕНТАРИИ:
• ФОРМУЛА: C4H6O4
• ИСТОЧНИКИ ДАННЫХ: СТАТЬЯ 4 | T3DB | PubChem | FSANZ и FSA | EAFUS | EPA | EPA | FSANZ и FSA | EAFUS | EPA Drugbank
• ПОСЛЕДНЕЕ ОБНОВЛЕНИЕ: 28/04/2018

---

Ассоциации здравоохранения

В основном сосредоточены на последствиях для здоровья длительного воздействия этого вещества

• СИМПТОМЫ: Острое воздействие: клиническими признаками острой токсичности являются слабость и понос.
• ВОЗМОЖНЫЕ ПОСЛЕДСТВИЯ ДЛЯ ЗДОРОВЬЯ: Янтарная кислота при высоких дозах или воздействии раздражает кожу. Хронически высокие дозы сукцината могут привести к сукцинилированию или сукцинированию различных ферментов. Частичный дефицит сукцинатдегидрогеназы (от 15% до 50% нормальной активности эталонного фермента) в скелетных мышцах приводит к повышению уровня сукцината и вызывает митохондриальную миопатию с различными симптомами, например поражением мозга, кардиомиопатией и / или непереносимостью физических упражнений. | Янтарная кислота может быть преобразована в фумаровую кислоту путем окисления через сукцинатдегидрогеназу.
• ДЕЙСТВИЕ ТОКСИНА: Сукцинат может ингибировать активность α-KG-зависимых оксигеназ (KDM) и 5-метилцитозин (5mC) гидроксилаз семейства TET. Сукцинат также опосредует аллостерическое ингибирование пролилгидроксилаз (PHD) индуцируемого гипоксией фактора (HIF). Ингибирование PHD HIF приводит к активации HIF-опосредованного псевдогипоксического ответа, тогда как ингибирование KDM и семейства TET из 5mC-гидроксилаз вызывает эпигенетические изменения, которые в конечном итоге вызывают рак. Сукцинация KEAP1 при дефиците FH приводит к конститутивной активации пути антиоксидантной защиты, опосредованного NRF2, создавая восстановительную среду, которая способствует пролиферации клеток.Сукцинация фермента цикла Кребса Aco2 снижает активность аконитазы в Fh2-дефицитных MEF. Сукцинация также вызывает необратимую инактивацию глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH). |
• ТОКСИНОВЫЕ УЧАСТКИ ДЕЙСТВИЯ В КЛЕТКЕ: «Цитоплазма», «внеклеточная»
• Дополнительные пути воздействия: Янтарная кислота является предшественником некоторых специализированных полиэфиров. Он также входит в состав некоторых алкидных смол. Янтарная кислота используется в пищевой промышленности и производстве напитков, прежде всего, как регулятор кислотности.Он также продается как пищевая и диетическая добавка и, как правило, признан безопасным FDA США.
СМОТРЕТЬ ПОБОЧНЫЕ ДЕЙСТВИЯ ЛЕКАРСТВ

---

Искать по всему Toxno Или просмотрите наши умопомрачительные, но устрашающие списки.

---

Био-янтарная кислота для продажи

Эта четырехуглеродистая дикарбоновая кислота используется в ряде промышленность, включая полимеры (волокна для одежды), пищевая промышленность, поверхностно-активные вещества и моющие средства, ароматизаторы и ароматизаторы и в качестве исходного материала для любого количества химикатов, включая адипиновую кислоту, N-метил пирролидинон, 2-пирролидинон, соли сукцината, 1,4-бутандиол, малеиновый ангидрид, тетрагидрофуран и гамма-бутиролактон, которые используются в фармацевтической промышленности.Янтарная кислота имеет множество применений в фармацевтической промышленности — слишком много, чтобы упоминания, но некоторые примеры служат в качестве исходного материала для активных фармацевтические ингредиенты (API) в качестве добавки в рецептуру, моноэтиловый эфир янтарной кислоты использовался в качестве инсулинотропного агент, и соединение также использовалось в качестве сшивающего агента в полимеры для контроля над наркотиками. В настоящее время во всем мире янтарная кислота используется примерно от 20 000 до 30 000 тонн в год, и эта цифра увеличивается примерно на 10 в год. цент в год — одна из причин, по которой он привлек еще одного игрока DSM из Нидерландов и Roquette из Франции анонсируют на этой неделе что они объединили свои усилия, чтобы коммерциализировать процесс на основе ферментации для производства биовозобновляемой янтарной кислоты из глюкозы и углекислого газа.Обе компании будут работать вместе, чтобы вывести онлайн демонстрационный завод в Лестреме, Франция, к 2009 г. способна производить несколько сотен тонн химиката в расчете на год. Затем ожидается, что технология будет применена в коммерческом масштаб к 2011 году. Использование глюкозы в качестве сырья вместо производства из малеиновый ангидрид (нефтехимический источник) снизит вдвое стоимость исходный материал (процесс превращения малеинового ангидрида в янтарная кислота также более дорога с точки зрения энергии, так как хорошо).Проект является прямым результатом проекта BioHub в размере 90 млн евро ($ 132 млн). программа, утвержденная в 2006 году Французским промышленным Агентство инноваций для развития связей между компаниями в том, что называется «белая биотехнология». Кристоф Рупп-Далем, член проектной группы Roquette, прокомментировал: « При производстве биоядерной кислоты DSM и У Roquette будет крутая кривая обучения, но мы считаем, что Разработанный нами биологический маршрут на основе микробной ферментации очень эффективный и даст более дешевую янтарную кислоту в более устойчивая мода, чем от нефтехимии .» Комментируя, почему две компании объединили свои усилия к этому проекту он добавил: « DSM и Roquette дополняют каждый другие очень хорошо, у них те же интересы, что и у биоперерабатывающих заводов, Roquette предоставляет больше информации о процессе, а DSM — от белая биотехнология и нижний конец «. Рупп-Далем продолжил говорят, что «технология была разработана с такой эффективностью, что DSM и Roquette рассчитывают, что смогут конкурировать и увеличивать рынок янтарной кислоты ». Зеленые полномочия В процессе производства янтарной кислоты будет использоваться простое сырье. как сырье, которое будет состоять из глюкозы (шести углеродных единиц) и СО2. Процесс будет простым брожением процесс с использованием безымянного микроорганизма, который просто производит янтарная кислота и отсутствие побочных продуктов (при незначительной очистке требуется в конце технологической цепочки, процесс будет стоить еще дороже. эффективный). Янтарная кислота была произведена из глюкозы различными ферментативные методы в прошлом с использованием таких микроорганизмов, как рекомбинантный штаммов Escherichia coli , Candida bombicola и Anaerobiospirillum succiniciproducens среди многих других, но не в коммерческих масштабах.Углекислый газ должен поступать из близлежащего биоэтанола. объекты, на которых ферментация сахарозы с дрожжами производит этанол и отходящий газ CO2 как выбросы в атмосферу (который теперь можно использовать для улавливания углерода и «закрепить» в новая молекула). Ферментация для получения янтарной кислоты также, по-видимому, будет намного более энергоэффективным, анализ жизненного цикла показал, что потребует примерно на 30-40 процентов меньше энергии, чем обычный химического производственного процесса, и это снова сэкономит атмосферу от еще большего количества выбросов углерода.Так что вроде процесс будет чистым (без побочных продуктов), экологически чистый (улавливает CO2) и будет использовать относительно дешевое сырье для производства (глюкоза), чтобы обеспечить более дешевый источник янтарной кислоты на растущем рынке. Химия теперь очевидна, а также спрос, но экономистам остается подтвердить коммерческую жизнеспособность.

Границы | Разработка Saccharomyces cerevisiae для производства янтарной кислоты из глицерина и диоксида углерода

Введение

Янтарная кислота (SA) традиционно использовалась в качестве поверхностно-активного вещества, ионного хелатора и добавки в сельском хозяйстве и пищевой промышленности (Ahn et al., 2016). Помимо этих традиционных применений, SA в настоящее время считается одним из самых многообещающих платформенных химикатов, которые можно производить из возобновляемых ресурсов (Dusselier et al., 2014; Pinazo et al., 2015). Фактически, SA может быть преобразована в большое количество химических веществ, включая 1,4-бутандиол, гамма-бутиролактон и тетрагидрофуран, а также в полимеры на биологической основе, такие как полибутиленсукцинат (PBS) (Werpy and Petersen, 2004; Ahn et al. ., 2016).

Некоторые бактерии, выделенные из рубца, такие как Mannheimia succiniciproducens (Lee et al., 2002; Scholten and Dägele, 2008) и Actinobacillus succinogenes (Guettler et al., 1999) естественным образом секретируют значительные количества СК. Однако эти организмы дикого типа ауксотрофны по нескольким витаминам и аминокислотам (Beauprez et al., 2010), и использование сложных сред нецелесообразно для экономичного производства сыпучих продуктов. Альтернативно, рациональная инженерия метаболических путей была применена к хорошо зарекомендовавшим себя модельным бактериям, таким как Escherichia coli и Corynebacterium glutamicum (Jantama et al., 2008; Окино и др., 2008). Хотя сообщалось об относительно высоких титрах и продуктивности, бактерии обычно считаются субоптимальными хозяевами для продуцирования СК, поскольку они восприимчивы к бактериофаговым инфекциям и проявляют низкую толерантность к кислотности (Los, 2012). Необходимость поддерживать нейтральный уровень pH требует громоздкой последующей обработки и, таким образом, приводит к образованию чрезмерного количества нежелательных побочных продуктов, как это обсуждали Янсен и ван Гулик (2014).

Дрожжи и грибы, как правило, более устойчивы к низкому pH и поэтому считаются многообещающими клеточными фабриками для производства органических кислот (Raab et al., 2010; Янсен и ван Гулик, 2014; Ан и др., 2016). Виды дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Pichia kudriavzevii ( Issatchenkia orientalis ) уже были успешно сконструированы для коммерческого производства СК, например, компаниями Reverdia и Bioamber в соответствии с обзором Ahn et al. (2016). Примечательно, что все попытки продуцировать СК в S. cerevisiae были основаны на глюкозе как источнике углерода, а титры и продуктивность СК все еще ниже, чем у бактерий-хозяев.

Три метаболических пути могут быть использованы для продукции СК у микроорганизмов: (i) окислительная и (ii) восстановительная ветвь цикла трикарбоновой кислоты (TCA), а также (iii) глиоксилатный цикл (Raab and Lang, 2011). Восстановительный путь SA дает максимально возможный выход, поскольку он сопровождается чистой фиксацией диоксида углерода (Beauprez et al., 2010). Последний путь был установлен в цитозоле штамма S. cerevisiae Yan et al. (2014), которые одновременно сверхэкспрессировали PYC2 , кодирующую пируваткарбоксилазу, перенаправили пероксисомальную малатдегидрогеназу ( MDh4 ) на цитозоль, экспрессировали фумаразу из E.coli ( fumC ) и сверхэкспрессирует эндогенную фумаратредуктазу ( FRD1 ). Авторы использовали ранее сконструированный базовый штамм [штамм S. cerevisiae TAM, отрицательный по пируватдекарбоксилазе (PDC)], который не может осуществлять спиртовую ферментацию (van Maris et al., 2004). Аналогичный цитозольный, восстановительный и связывающий диоксид углерода путь был установлен в S. cerevisiae компанией Reverdia для коммерческого производства СК на биологической основе с использованием глюкозы в качестве единственного источника углерода (van de Graaf et al., 2015, Патент № US20150057425A1). Другое исследование продемонстрировало, что дополнительная экспрессия транспортера дикарбоновой кислоты из Aspergillus niger (кодируемого An DCT-02) играет решающую роль для получения высоких титров и выходов SA (Jansen et al., 2017, Patent No. US9624514B2 ).

Важно отметить, что производство двух молекул SA из одной молекулы глюкозы (и двух молекул углекислого газа) посредством гликолиза и восстановительного пути SA не является окислительно-восстановительным и требует ввода дополнительных электронов в виде НАДН (рисунок 1).Интересным альтернативным источником углерода для производства СК посредством привлекательного восстановительного пути является глицерин, молекула, в которой углерод более восстановлен, чем в глюкозе. Как показано на рисунке 1, две молекулы SA могут быть получены из двух молекул глицерина (и двух молекул углекислого газа) по окислительно-восстановительному пути. Это обеспечивает более высокий максимальный теоретический выход в г СК / г потребленного субстрата (т.е. 1,28 г / г глицерина против 1,12 г / г глюкозы). Глицерин является основным побочным продуктом процесса переэтерификации при производстве биодизеля (Clomburg and Gonzalez, 2013).Хотя будущее биодизельной промышленности остается неопределенным (Naylor and Higgins, 2017), изучение производства СК из источников углерода, которые не приводят к подавлению катаболизма углерода, представляет интерес с точки зрения будущих технологий, которые могут использовать источники углерода C1, такие как метанол. или формиат (Cotton et al., 2020).

Рисунок 1. В отличие от глюкозы, производство СК из глицерина посредством восстановительного пути СК, фиксирующего диоксид углерода, является окислительно-восстановительным.Пунктирные линии представляют несколько реакций. GA3P, глицеральдегид-3-фосфат; SA, янтарная кислота.

Важно отметить, что более высокая восстанавливающая способность глицерина может быть полностью использована для ферментативных путей у S. cerevisiae только в том случае, если электроны сохраняются в форме цитозольного НАДН. Однако естественный путь L-глицерин-3-фосфата (L-G3P) переносит электроны через FADH ₂ в дыхательную цепь. Наша группа ранее заменила нативный путь L-G3P альтернативным путем, в котором дигидроксиацетон (DHA) является промежуточным звеном (Klein et al., 2016). Соответствующие штаммы используют глицерин зависимым от NAD образом, как показано на рисунке 2.

Рисунок 2. Генетические модификации для установления восстановительного, связывающего углекислый газ и окислительно-восстановительного пути от внеклеточного глицерина к внеклеточной SA в S. cerevisiae . Затенение серым цветом указывает на целевой путь; однако показаны и другие эндогенные метаболические пути, потенциально ведущие к СА. Пунктирные линии представляют несколько реакций.Пероксисома не показана. DHA, дигидроксиацетон; DHAP, дигидроксиацетонфосфат; GA3P, глицеральдегид-3-фосфат; STL1 , глицерин / H ⁺ симпортер; DAK1 / 2 , дигидроксиацетонкиназа; PYC1 / 2 , пируваткарбоксилаза; МДх2 / МДх3 / МДх4 , малатдегидрогеназа; FUM1 , фумараза; SDh2-4 , сукцинатдегидрогеназа; CIT1 / 2/3 , цитратсинтаза; ACO1 , аконитаза; ICL1 , изоцитратлиаза; MLS1 , малатсинтаза; ACS1 / 2 , ацетил-КоА синтетаза; PDC1 / 5/6 , пируватдекарбоксилаза; ADh2 / 2/4/5 , алкогольдегидрогеназа; ALD2 / 3/6 , альдегиддегидрогеназа; CjFPS1 , глицерин из C.jadinii ; Opgdh , глицериндегидрогеназа из O. parapolymorpha ; MDh4-R , пероксисомальная малатдегидрогеназа, направленная в цитозоль; RofumR , фумараза из R. oryzae ; TbFRDg-R , гликозомальная фумаратредуктаза из T. brucei , перенаправленная на цитозоль; DCT-02, переносчик дикарбоновой кислоты из A. niger .

Целью настоящего исследования было установить цитозольный восстановительный путь SA и транспортер An DCT-02 в ранее созданном «штамме пути DHA» S.cerevisiae и проанализировать эффективность полученного штамма в отношении продукции СК из глицерина и диоксида углерода. Основное внимание в этом исследовании уделялось изучению роли глиоксилатного цикла для продукции SA из глицерина в сконструированном штамме S. cerevisiae , снабженном восстановительным путем SA. Фактически, ранее было продемонстрировано, что ключевые ферменты глиоксилатного цикла сильно активируются на уровне транскрипции глицерина по сравнению с глюкозой (Roberts and Hudson, 2006).

Материалы и методы

Штаммы и обслуживание

Штаммы, использованные в этом исследовании, перечислены в таблице 1. Дрожжевые клетки обычно выращивали на твердой среде YPD, содержащей 10 г / л дрожжевого экстракта, 20 г / л пептона, 20 г / л глюкозы и 15 г / л агара. Чашки с агаром культивировали в статическом инкубаторе при 30 ° C. В среду добавляли флеомицин (20 мг / л), гигромицин B (300 мг / л) или нурсеотрицин (100 мг / л) для целей отбора при необходимости. E. coli DH5α использовали для конструирования и выделения плазмиды, и клетки обычно выращивали в лизогенном бульоне (LB), содержащем 10 г / л NaCl, 5 г / л дрожжевого экстракта, 10 г / л пептона, и доводили до pH 7.5 с 2 М NaOH (Бертани, 1951). Для отбора и поддержания клеток, содержащих плазмиду, добавляли ампициллин 100 мг / л.

Таблица 1. штаммов S. cerevisiae , использованных в этом исследовании.

Общие методы молекулярной биологии

Препаративные ПЦР для клонирования, а также для определения последовательности экспрессионных кассет, интегрированных в геном, проводили с использованием высокоточной ДНК-полимеразы Phusion ^® (New England BioLabs, Франкфурт-на-Майне, Германия).Условия ПЦР были адаптированы к рекомендациям соответствующего производителя. Рестрикционные ферменты, щелочная фосфатаза FastAP и ДНК-лигаза Т4 были получены от Thermo Fisher Scientific (Уолтем, Массачусетс, США) и использовались в соответствии с инструкциями производителя. Продукты ПЦР очищали с использованием набора для очистки GeneJET PCR Purification Kit (Thermo Fischer Scientific), и фрагменты ДНК, полученные после рестрикции, вырезали и очищали с использованием набора QIAquick Gel Purification Kit (Qiagen, Hilden, Германия).Трансформацию S. cerevisiae плазмидами, а также кассетами линейной экспрессии для геномной интеграции проводили в соответствии с методом с ацетатом лития, описанным Gietz et al. (1995).

Конструирование кассет экспрессии для геномной интеграции

Плазмиды, использованные в этом исследовании, перечислены в дополнительной таблице S1. Оптимизированные по кодонам кодирующие последовательности для S. cerevisiae MDh4 , Rhizopus oryzae fumR , Trypanosoma brucei FRDg и Aspergillus niger DCT-02 были любезно предоставлены Royal DSM N.В. (Делфт, Нидерланды). Mdh4 и Frd были нацелены в цитозоль путем удаления пероксисомального сигнала нацеливания (SKL) из белка, далее обозначаемого как MDh4 — R и Tb FRD g — R , соответственно ( van de Graaf et al., 2015, патент № US20150057425A1). Кассеты для экспрессии MDh4-R под контролем промотора PGK1 и терминатора IDP1 , RofumR под контролем промотора TEF1 и терминатора RPL15A , -TbFRD под контролем промотора TDh4 и терминатора CYC1 и An DCT-02 под контролем промотора ENO2 и терминатора DIT1 были собраны в pUC18 с использованием изотермической сборки Гибсона (Gibson et al. al., 2009). Все праймеры, используемые для амплификации соответствующих промоторов, кодирующих последовательностей и терминаторов, перечислены в дополнительной таблице S2. Все промоторы и терминаторы были амплифицированы из геномной ДНК, выделенной из штамма S. cerevisiae S288C. Одностадийные изотермические реакции сборки ДНК содержали 15 мкл смеси реагент-фермент, как описано Gibson et al. (2009), 0,05 пмоль линеаризованной pUC18 Bam HI и трехкратный избыток вставок [промотор, кодирующая последовательность и терминатор (каждый 0.15 пмоль)] в конечном объеме 20 мкл. Реакционные смеси инкубировали при 50 ° C в течение 1 ч, а затем 5 мкл реакционной смеси непосредственно использовали для трансформации E. coli DH5α. Полученные векторы были названы pUC18- MDh4-R , pUC18- RofumR , pUC18- TbFRDg-R и pUC18- An DCT-02 (дополнительная таблица S1).

Плазмиды для редактирования генома, опосредованного CRISPR-Cas9, у S. cerevisiae

Для редактирования генома, опосредованного CRISPR-Cas9, векторы p414-TEF1p-Cas9-CYC1t-nat1 (Klein et al., 2016), p426-SNR52p-gRNA.YGLCτ3-SUP4t — hphMX (Islam et al., 2017) и p426-SNR52p-gRNA.YPRCτ3-SUP4t-hphMX (дополнительная таблица S1). Вектор p426-SNR52p-gRNA.YPRCτ3-SUP4t-hphMX был сконструирован из p426-SNR52p-gRNA.CAN1.Y-SUP4t-hphMX (Klein et al., 2016) путем замены 20-нуклеотидной последовательности на 5′-конце экспрессировали гРНК, нацеленную на ген S. cerevisiae CAN1 , с помощью последовательности из 20 нуклеотидов, нацеленной на длинный концевой повтор YPRCτ3 на хромосоме XVI (Flagfeldt et al., 2009).Новую последовательность-мишень вставляли путем создания двух перекрывающихся продуктов ПЦР кассеты экспрессии гРНК и их последующей сборки в одном и том же скелете вектора согласно Гибсону и соавт. (2009). Онлайн-инструмент CRISPRdirect, разработанный Наито и соавт. (2015) использовали для выбора целевой последовательности в локусе YPRCτ3. Праймеры 463 и 596, 460 и 597 (дополнительная таблица S2) использовали для амплификации перекрывающихся фрагментов кассеты экспрессии гРНК из p426-SNR52p-gRNA.CAN1.Y-SUP4t-hphMX.Праймеры 460 и 463 создавали перекрытия с концами линеаризованной p426-SNR52p-gRNA.CAN1.Y-SUP4t-hphMX Pvu II, тогда как праймеры 596 и 597 создавали перекрытия, содержащие нацеливающую последовательность YPRCτ3. Линеаризованная p426-SNR52p-gRNA Pvu II.CAN1.Y-SUP4t-hphMX очищали в геле после рестрикции. Изотермическую сборку Гибсона проводили, как описано в разделе «Конструирование экспрессионных кассет для геномной интеграции», с получением p426-SNR52p-gRNA.YPRCτ3-SUP4t-hphMX.

с.cerevisiae Конструкция штамма

Общие стратегии геномной интеграции с использованием системы CRISPR-Cas9

Для геномной интеграции использовались длинные концевые повторы YGLCτ3 и YPRCτ3 на хромосомах VII и XVI (Flagfeldt et al., 2009). Экспрессия Cas9 в желаемом штамме была достигнута трансформацией плазмидой p414-TEF1p-Cas9-CYC1t-nat1 (дополнительная таблица S1). Во всех штаммах «модуль SA» был интегрирован в локус YGLCτ3 (с помощью экспрессии гРНК из p426-SNR52p-gRNA.YGLCτ3-SUP4t — л / чMX). Кассета экспрессии для An DCT-02 была интегрирована либо в локус YPRCτ3 (с использованием p426-SNR52p-gRNA.YPRCτ3-SUP4t-hphMX для экспрессии гРНК) в штаммах UBR2 _CBS -DHA- An DCT 02 и UBR2 _CBS -DHA-SA- An DCT-02 или вместе с «модулем SA» в локусе YGLCτ3 в штамме UBR2 _CBS -L-G3P-SA- An DCT -02. Кассеты экспрессии амплифицировали с помощью ПЦР из плазмид, несущих соответствующие кассеты экспрессии, с использованием пар праймеров, перечисленных в дополнительной таблице S2.Эти праймеры содержали 5′-удлинения, генерирующие последовательности 40-60 п.н., гомологичные областям, расположенным непосредственно выше и ниже вставленного двухцепочечного разрыва в сайте интеграции или в соответствующей соседней кассете экспрессии (в случае, если несколько кассет были собраны в одном и том же локусе). Совместная трансформация штамма S. cerevisiae , экспрессирующего эндонуклеазу Cas9, с кассетами экспрессии и соответствующим вектором для экспрессии гРНК приводила к сборке и интеграции всех кассет экспрессии в целевом локусе.Положительные трансформанты отбирали на агаре YPD, содержащем как норсеотрицин, так и гигромицин B. Оба вектора впоследствии удаляли из полученного клона путем серийных переносов в среду YPD, не содержащую соответствующих антибиотиков, с получением желаемого штамма. Впоследствии все интегрированные кассеты экспрессии секвенировали.

Делеция ICL1 была получена с использованием разрушающей кассеты, состоящей из маркера устойчивости к флеомицину ( ble, , ^r ), фланкированного областями, комплементарными областям, расположенным выше и ниже соответствующего удаляемого гена.Кассету делеции амплифицировали из плазмиды pUG66 (дополнительная таблица S1) с использованием праймеров 1243 и 1244 (дополнительная таблица S2). Праймеры содержат на своем 5′-конце последовательность из 60 п.н., комплементарную области, расположенной непосредственно выше или ниже старт-кодона или стоп-кодона гена, подлежащего делеции.

Штамм SA

Кассеты экспрессии для MDh4-R , RofumR и TbFRDg-R были амплифицированы с помощью ПЦР из плазмид pUC18- MDh4-R , pUC18- RofumR и pUCb18- 90DRg с использованием пары праймеров 690/770, 771/590 и 591/772 соответственно (дополнительные таблицы S1, S2).Впоследствии они были интегрированы в локус YGLCτ3 штамма CEN.PK113-1A ( MATa ) с использованием системы CRISPR-Cas9, давая штамм SA. Штамм CEN.PK113-1A ( MATa ) был получен путем изменения типа спаривания штамма CEN.PK113-1A с MATα на MATα с использованием той же стратегии, что описана в Ho et al. (2017).

Штамм

UBR2 _CBS -DHA-SA

Для приведения в действие «модуля SA» UBR2 _CBS -DHA (CEN.PK 113-1A UBR2 _{CBS 6412–13A} gut1: Opgdh-DAK1-CjFPS1-DAK1 _{OE– 2} в Klein et al., 2016), два штамма были скрещены, как показано на дополнительном рисунке S1. Эту стратегию использовали, чтобы избежать событий гомологичной рекомбинации между промоторами и терминаторами, которые использовали для генерации кассет экспрессии, которые должны были быть интегрированы, с кассетами, уже присутствующими в штамме UBR2 _CBS -DHA после трансформации.

Спаривание, споруляцию и тетрадный анализ выполняли с помощью процедур, описанных Sherman and Hicks (1991).Тетрады препарировали с помощью микроманипулятора от Singer Instruments Co., Ltd. (Roadwater Watchet Somerset, Великобритания). Типы спаривания определяли с помощью диагностической ПЦР для локуса MAT (Huxley et al., 1990). ПЦР типа спаривания выполняли для проверки гаплоидности полученных сегрегантов, в то время как наличие «DHA» и «модулей SA» проверяли с помощью диагностической ПЦР и секвенирования. После этого был секвенирован UBR2 в соответствующем гаплоидном штамме, чтобы убедиться, что гаплоидные штаммы содержат аллель UBR2 из CBS 6412-13A ( UBR _{CB S} ) (Swinnen et al., 2016).

Штаммы

UBR2 _CBS -DHA- An DCT-02 и UBR2 _CBS -DHA-SA- An DCT-02

Кассета экспрессии для An DCT-02 была амплифицирована с помощью ПЦР из плазмиды pUC18- An DCT-02 с использованием пары праймеров 871/872 (дополнительные таблицы S1, S2). Затем кассету интегрировали в локус YPRCτ3 штаммов UBR2 _CBS -DHA и UBR2 _CBS -DHA-SA, соответственно, с использованием системы CRISPR-Cas9, как описано выше, с получением штаммов UBR2 _CBS -DHA- An DCT-02 и UBR2 _CBS -DHA-SA- An DCT-02.

Штамм

UBR2 _CBS -L-G3P-SA- An DCT-02

Три кассеты экспрессии ( MDh4-R , RofumR и TbFRDg-R ) «модуля SA» и кассета экспрессии для An DCT-02 были амплифицированы из плазмид pUC18- MDh4- R , pUC18- Rofum R , pUC18- TbFRDg-R и pUC18- An DCT-02 с использованием пар праймеров 991/770, 771/590, 591/992 и 993/872, соответственно (дополнительные таблицы S1 , S2).Все четыре кассеты экспрессии для «модуля SA» и An DCT-02 были интегрированы в локус YGLCτ3 ранее созданного штамма CEN.PK113-1A UBR2 _CBS CjFPS1 (Таблица 1; Swinnen et al., 2016 ) с использованием системы CRISPR-Cas9, как описано выше, в результате получился штамм UBR2 _CBS -L-G3P -SA- An DCT-02.

Выделение геномной ДНК из

трансформантов S. cerevisiae и диагностическая ПЦР

Правильная интеграция всех кассет экспрессии и разрушения была подтверждена диагностической ПЦР с использованием ДНК-полимеразы OneTaq Quick-load и буфера в соответствии с инструкциями производителя (New England Biolabs, Великобритания).Геномную ДНК выделяли согласно модифицированному протоколу Хоффмана и Уинстона (1987). Одиночные колонии, полученные после трансформаций, повторно наносили штрихами на соответствующие чашки с агаром. Приблизительно 50 мг клеток из этих планшетов суспендировали в 200 мкл буфера ТЕ (10 мМ Трис, 1 мМ ЭДТА, pH 8,0). Затем добавляли 300 мг промытых кислотой стеклянных шариков (диаметр 0,425–0,6 мм) и 200 мкл смеси фенол: хлороформ: изоамиловый спирт (25: 24: 1). Пробирки встряхивали на максимальной скорости в течение 2 минут и центрифугировали при 15 700 g в течение 10 минут.Водную фазу (1 мкл) использовали в качестве матрицы в реакциях ПЦР на 20 мкл. Праймеры для ПЦР были сконструированы для связывания выше и ниже сайтов геномной интеграции, а также внутри интегрированной кассеты экспрессии / делеции. Для анализа интеграции нескольких кассет экспрессии были разработаны дополнительные праймеры для получения ампликонов, покрывающих соединения между отдельными интегрированными кассетами экспрессии. После каждого этапа интеграции проверяли наличие всех ранее интегрированных кассет экспрессии.

Среда и условия культивирования для получения СК из глицерина

Все предварительные культуры культивировали в синтетической среде, содержащей 20 г / л глюкозы и сульфата аммония в качестве источника углерода и азота, соответственно. Все эксперименты по оценке продукции СК при периодическом культивировании во встряхиваемой колбе проводили в синтетической среде, содержащей 60 мл / л (75,6 г / л) глицерина в качестве единственного источника углерода с мочевиной в качестве источника азота. Синтетическая среда была приготовлена ​​согласно Verduyn et al.(1992), содержащий 3 г / л KH ₂ PO ₄ , 0,5 г / л MgSO ₄ .7H ₂ O, 15 мг / л ЭДТА, 4,5 мг / л ZnSO ₄ .7H ₂ O, 0,84 мг / л MnCl ₂ .2H ₂ O, 0,3 мг / л CoCl ₂ .6H ₂ O, 0,3 мг / л CuSO ₄ .5H ₂ O, 0,4 мг / Л NaMoO ₄ .2H ₂ O, 4,5 мг / л CaCl ₂ .2H ₂ O, 3 мг / л FeSO ₄ .7H ₂ O, 1 мг / лH ₃ BO ₃ и 0.1 мг / л KI. После тепловой стерилизации среды добавляли стерилизованные фильтрованием витамины. Конечные концентрации витаминов составляли: 0,05 мг / л D — (+) — биотина, 1 мг / л гемикальциевой соли D-пантотеновой кислоты, 1 мг / л никотиновой кислоты, 25 мг / л мио-инозитола, 1 мг / л гидрохлорида хлорида тиамина. , 1 мг / л гидрохлорида пиридоксина и 0,2 мг / л 4-аминобензойной кислоты. В случае использования мочевины в качестве источника азота (в основной культуральной среде) после автоклавирования добавляли соответствующую аликвоту исходного раствора для получения конечной концентрации 2.8 г / л, в то время как во всех других культурах перед тепловой стерилизацией добавляли 5 г / л сульфата аммония (в предкультурной среде). PH синтетической глюкозной среды доводили до 6,5 с помощью 4 M КОН, а pH синтетической глицериновой среды доводили до 4,0 с помощью 2 M H ₃ PO ₄ .

Для предварительного культивирования клетки из одной колонии использовали для инокуляции 3 мл синтетической глюкозной среды в стеклянной пробирке объемом 10 мл и инкубировали при орбитальном встряхивании 200 об / мин и 30 ° C в течение 16 часов. Предварительное культивирование использовали для инокуляции 10 мл той же среды в колбе Эрленмейера на 100 мл, устанавливая OD ₆₀₀ равным 0.2. Эту культуру, далее называемую промежуточной культурой, культивировали в тех же условиях в течение 48 часов. Соответствующий объем культуры из промежуточной культуры (для того, чтобы позже установить OD ₆₀₀ 0,2 в 100 мл синтетической глицериновой среды) центрифугировали при 800 g в течение 5 минут и супернатант отбрасывали. Затем осадок клеток промывали один раз путем повторного суспендирования клеток в синтетической глицериновой среде. Суспензию клеток снова центрифугировали и ресуспендировали в 100 мл той же среды в колбе Эрленмейера на 500 мл.Основные культуры инкубировали при орбитальном встряхивании 200 об / мин и 30 ° C, и образцы для определения OD ₆₀₀ и анализа ВЭЖХ отбирали через равные промежутки времени. Биомассу культуры для штамма UBR2 _CBS -DHA определяли путем корреляции измерений OD ₆₀₀ с сухой массой. В качестве представителя для определения корреляции был использован этот штамм.

Анализ метаболитов методом ВЭЖХ

Образцы супернатантов культур (1 мл) сначала фильтровали через 0.Мембранные фильтры Minisart RC с размером пор 2 мкм (Sartorius, Göttingen, Германия) и, при необходимости, хранятся при -20 ° C до анализа. Концентрации СК, глицерина и этанола в питательных средах определяли с помощью системы ВЭЖХ Waters (Эшборн, Германия), состоящей из бинарной насосной системы (Waters 1525), системы инжектора (Waters 2707), модуля нагревателя колонки Waters WAT038040, рефракционного индексный (RI) детектор (Waters 2414) и детектор поглощения с двумя длинами волн (Waters 2487). Образцы вводили в катионообменную колонку Aminex HPX-87H (Biorad, Мюнхен, Германия), соединенную с колонкой Micro-guard ^® (Biorad), и элюировали 5 мМ H ₂ SO ₄ в качестве подвижной фазы. при расходе 0.6 мл / мин и температура колонки 45 ° C. Для инъекции использовали объемы образца 20 мкл. SA детектировали с использованием детектора поглощения с двумя длинами волн (Waters 2487), тогда как этанол и глицерин анализировали с помощью детектора RI (Waters 2414). Время удерживания SA составляло 11,2 мин, глицерина 13,5 мин и этанола 22,7 мин. Данные обрабатывали и анализировали с помощью программы Breeze 2 (Waters).

Эксперименты в биореакторе

Для каждого эксперимента биореактора клетки из одной колонии использовали для инокуляции 100 мл синтетической среды, содержащей 75.6 г / л глицерина (приготовленный, как описано в разделе «Среда и условия культивирования для получения СК из глицерина», но вместо мочевины в качестве источника азота использовался сульфат аммония) в круглодонных колбах на 500 мл и инкубировали в Innova. 44 (New Brunswick Scientific, Эдисон, Нью-Джерси, США), установленный на 30 ° C и 200 об / мин в течение ночи. Затем клетки, экспоненциально растущие в свежей среде, использовали для инокуляции биореакторов при исходной OD 1,0, измеренной при 600 нм на спектрофотометре Libra S12 (Biochrom, Кембридж, Великобритания).Аэробные периодические культуры выращивали в биореакторах объемом 2 л (Applikon, Делфт, Нидерланды) при начальном рабочем объеме 1 л синтетической глицериновой среды с сульфатом аммония (5 г / л) в качестве источника азота. Чтобы поддерживать более высокие концентрации биомассы, концентрации витаминов и микроэлементов были увеличены (в два раза), и дополнительный биотин был добавлен отдельно для достижения конечной концентрации среды 1 мг / л, как описано Wahl et al. (2017). PH культуры поддерживали на уровне 5,0 с помощью автоматического добавления 10 М КОН, а температуру поддерживали на уровне 30 ° C.Поступающий газ представлял собой поточную смесь сжатого воздуха и чистого диоксида углерода (чистота> 99,7%, Linde Gas Benelux, Schiedam, Нидерланды) при комбинированной скорости потока 500 мл / мин, контролируемой с помощью регуляторов массового расхода (Brooks, Hatfield, PA. , Соединенные Штаты). Полученная газовая смесь содержала 10,3% диоксида углерода и 18,6% кислорода. Биореактор перемешивали со скоростью 800 об / мин. Образцы для определения OD ₆₀₀ и анализа ВЭЖХ отбирали через равные промежутки времени.

Анализ отходящих газов, определение биомассы и внеклеточных метаболитов

Выхлопной газ из биореактора охлаждали с помощью конденсатора до 2 ° C и сушили с помощью PermaPure Dryer (модель MD 110-8P-4; Inacom Instruments, Венендал, Нидерланды).Осушенный газ анализировали на содержание диоксида углерода и кислорода с помощью комбинированного парамагнитного / инфракрасного анализатора отходящих газов NGA2000 Analyzer (Rosemount, Баар, Швейцария). Концентрации биомассы определяли путем фильтрования дубликатов точных объемов культурального бульона (5 мл) над предварительно высушенными мембранными фильтрами Supor 47 с размером пор 0,45 мкм, промывали и затем сушили в микроволновой печи в течение 20 минут при 360 Вт и взвешивали. снова (Pall Laboratory, Порт Вашингтон, Нью-Йорк, США), как описано Postma et al.(1989). Внеклеточные метаболиты культур получали центрифугированием образцов культур (10 мин при 3500 g), из которых супернатант анализировали с помощью ВЭЖХ, как описано ранее Hakkaart et al. (2020).

Результаты

Установление генетических модификаций, направленных на уменьшение продукции СК и ее экспорт в штамме

S. cerevisiae , оснащенном путем DHA

A S. cerevisiae производное CEN.PK113-1A, в котором нативный FAD-зависимый L-G3P путь катаболизма глицерина заменен на NAD-зависимый путь DHA (Klein et al., 2016) использовался в качестве исходного штамма. Помимо генетических модификаций, ранее называвшихся «модулем II пути DHA», этот штамм нес замену эндогенного аллеля UBR2 соответствующим аллелем из утилизирующего глицерин изолята дикого типа CBS 6412-13A ( UBR2 _{CB S} ), как описано Swinnen et al. (2016). Последняя модификация оказалась решающей для «штамма пути DHA» для достижения максимальной удельной скорости роста (μ _max ), равной ∼0.26 ч ^–1 в синтетической глицериновой среде (Klein et al., 2016). В настоящем исследовании используемый исходный штамм обозначается как штамм UBR2 _CBS -DHA (Таблица 1). Модуль пути DHA («модуль DHA») состоит из всех генетических модификаций, необходимых для экспрессии НАД-зависимой глицериндегидрогеназы из Ogataea parapolymorpha ( Op gdh), сверхэкспрессии эндогенного DAK1 (две кассеты экспрессии, каждый под контролем другого промотора), а также экспрессия акваглицеропорина Fps1 из Cyberlindnera jadinii ( Cj Fps1) для увеличения скорости поглощения глицерина.В описанном штамме путь L-G3P эффективно устранен, поскольку все четыре кассеты экспрессии были интегрированы в GUT1 (Klein et al., 2016).

Штамм UBR2 _CBS -DHA использовали для установления цитозольного восстановительного пути SA от оксалоацетата к SA, используя стратегию, использованную van de Graaf et al. (2015). Более подробно, мы (более) экспрессировали эндогенную пероксисомальную малатдегидрогеназу ( MDh4 ), которая отвечает за восстановление оксалоацетата, гетерологичную цитозольную фумаразу ( fumR ) из Rhizopus oryzae за превращение малата в пероксистомарат и фумаратеомал редуктаза ( FRD г) из Trypanosoma brucei для восстановления фумарата (рис. 2).Для нацеливания Mdh4 и Frd в цитозоль пероксисомные нацеленные сигналы (SKL) были удалены из белков (соответствующие гены обозначены здесь как MDh4 — R и TbFRDg-R ). Вышеупомянутые генетические модификации в совокупности называются «модулем SA» на протяжении всего исследования (рис. 2), а полученный штамм был назван UBR2 _CBS -DHA-SA. Впоследствии мы вставили кассету экспрессии для транспортера дикарбоновой кислоты, кодируемого An DCT-02, в результате чего был получен штамм UBR2 _CBS -DHA-SA- An DCT-02 (см. Раздел «Материалы и методы» для подробности).

В попытке исследовать эффект единственной экспрессии переносчика An DCT-02 (без «модуля SA») был сконструирован штамм UBR2 _CBS -DHA- An DCT-02. Кроме того, были сконструированы делеционные мутанты icl1 для штаммов UBR2 _CBS -DHA- An DCT-02 и UBR2 _CBS -DHA-SA- An DCT-02. ICL1 кодирует изоцитратлиазу, которая является одним из двух ключевых ферментов глиоксилатного цикла (рис. 2), и мутанты были использованы для проверки вклада эндогенного глиоксилатного цикла на образование СК в соответствующих штаммах.Стоит отметить, что предыдущее исследование в нашей лаборатории показало, что отмена глиоксилатного цикла (делеция ICL1 ) не оказала значительного влияния на рост нашего исходного штамма UBR2 _CBS -DHA в синтетической глицериновой среде (Xiberras и др., 2020). Однако этот результат не исключает полностью того, что углерод направляется через глиоксилатный цикл.

Ферменты как «модуля СК», так и эндогенного глиоксилатного цикла способствуют выработке СК синергетическим образом

Штаммы UBR2 _CBS -DHA, UBR2 _CBS -DHA- An DCT-02, UBR2 _CBS -DHA-SA- An DCT-0230, а также DCT-0230 Мутанты с делецией icl1 , соответствующие двум последним штаммам, были сначала протестированы в экспериментах с встряхиваемыми колбами с использованием синтетической глицериновой среды.В отличие от исследования Klein et al. (2016), мочевина использовалась в качестве источника азота вместо сульфата аммония, чтобы минимизировать дальнейшее подкисление и слабый кислотный стресс (de Kok et al., 2012). Мы использовали 100 мл среды во встряхиваемых колбах на 500 мл. Ранее было показано, что такая установка индуцирует некоторую алкогольную ферментацию у штаммов пути DHA S. cerevisiae (Aßkamp et al., 2019). Идея заключалась в том, чтобы создать здесь условия, при которых дыхательный метаболизм ограничен, чтобы увеличить доступность цитозольного НАДН и облегчить переход к СК в штаммах, оснащенных окислительно-восстановительным путем.

Как и ожидалось, для исходного штамма UBR2 _CBS -DHA можно было обнаружить только незначительные количества SA (фон дикого типа ICL1 ). Однако в супернатанте культуры было обнаружено до 1,6 г / л природного продукта ферментации этанола. Интересно, что единственная экспрессия An DCT-02 в UBR2 _CBS -DHA оказала значительное влияние на физиологию штамма. Это привело к снижению удельной скорости роста и расхода глицерина и образованию 3.2 г / л СК после 168 ч культивирования без детектируемого производства этанола (рис. 3А). Этот результат означает, что транспортер An DCT-02 был способен даже способствовать значительной экскреции SA, образованной исключительно эндогенными путями.

Рисунок 3. Производство СК, этанола и биомассы, а также потребление глицерина в экспериментах с встряхиваемыми колбами со штаммами S. cerevisiae UBR2 _CBS -DHA, UBR2 _CBS -DHA- An DCT-02 и UBR2 _CBS -DHA-SA- An DCT-02 (A) и штаммы UBR2 _CBS -DHA- An DCT-02 icl1 Δ и UBR2 _CBS -DHA-SA- An DCT-02 icl1 Δ (B) .Культивирование проводили в колбах на 500 мл, содержащих 100 мл синтетической среды, содержащей 75,6 г / л глицерина в качестве единственного источника углерода, и культуральные супернатанты анализировали с помощью ВЭЖХ на образование СК, этанола и потребления глицерина. Рост регистрировали путем измерения оптической плотности при 600 нм. Биомассу культуры определяли путем сопоставления измерений OD ₆₀₀ с сухой массой, как описано в разделе «Материалы и методы». Средние значения и стандартные отклонения определяли по меньшей мере в трех биологических повторностях.

Дополнительная экспрессия «модуля SA» в цитозоле штамма UBR2 _CBS -DHA- An DCT-02 привела к значительному увеличению титра продукта. Максимальный титр составил 10,7 г / л через 168 ч, что соответствует выходу 0,22 ± 0,01 г СК / г глицерина. Примечательно, что единственное присутствие «модуля SA» в штамме UBR2 _CBS -DHA (без An DCT-02) привело к значительному улучшению роста по сравнению с исходным штаммом, но только к незначительной продукции SA (1 .6 г / л; данные не показаны).

SA является промежуточным звеном глиоксилатного цикла, и известно, что ключевые ферменты этого пути (изоцитратлиаза и малатсинтаза) сильно активируются, когда S. cerevisiae выращивают в среде, содержащей глицерин в качестве единственного источника углерода, т. Е. Уровни мРНК были значительно увеличены по сравнению с уровнями, полученными из клеток, растущих в среде, содержащей глюкозу (Roberts and Hudson, 2006). Таким образом, было неясно, действительно ли СК, образующаяся в штаммах UBR2 _CBS -DHA- An DCT-02 и UBR2 _CBS -DHA-SA- , DCT-02 действительно является результатом установленного восстановительного путь фиксации углекислого газа.Мы удалили ICL1 в соответствующих штаммах, чтобы получить представление о вкладе глиоксилатного цикла. Соответствующие делеции привели к полному устранению и значительному снижению образования SA в UBR2 _CBS -DHA- An DCT-02 и UBR2 _CBS -DHA-SA- An DCT-02 соответственно. (Рисунки 3A, B). Интересно, что делеция ICL1 не повлияла отрицательно на рост и потребление глицерина, но даже немного улучшила (Фигуры 3A, B).Однако этанол (до 4,9 г / л) стал преобладающим продуктом ферментации у этих мутантов (рис. 3В). В то время как было промежуточное повышение pH с 4 до 6 для штаммов UBR2 _CBS -DHA, UBR2 _CBS -DHA- An DCT-02 icl1 Δ и UBR2 _CBS -DHA-SA- An DCT-02 icl1 Δ (дополнительный рисунок S2), производство СК, по-видимому, противодействовало этому увеличению рН, поскольку оно было гораздо менее выражено у штаммов, продуцирующих СК UBR2 _CBS — DHA- An DCT-02 и UBR2 _CBS -DHA-SA- An DCT-02.

Значительное снижение продукции СК, вызванное отменой активности ключевого фермента глиоксилатного цикла Icl1, предполагает, что основная часть СК в штамме UBR2 _CBS -DHA-SA- An DCT-02 включает углерод поток через последний путь (рис. 2). Фактически, только комбинированная активность как «модуля SA», так и эндогенного пути через обход PDH и глиоксилатный цикл (см. Рисунок 2) позволила получить самую высокую продукцию SA (10,7 г / л).

Мы также проверили, в какой степени генетические модификации «модуля DHA» (замена нативного FAD-зависимого пути L-G3P на путь DHA, доставляющего NADH, и присутствие гетерологичного Fps1) способствовали гиперпродукции SA на генетическом фоне. штамма UBR2 _CBS -DHA-SA- An DCT-02.С этой целью было сконструировано соответствующее производное CEN.PK113-1A, которое катаболизировало глицерин через путь L-G3P, но также содержало «модуль SA» и An DCT-02 (штамм UBR2 _CBS -L-G3P -SA- An DCT-02, см. Раздел «Материалы и методы»). Последний штамм показал сильно сниженное образование СК (с 10,7 до 3,2 г / л) по сравнению с изогенным штаммом с «модулем DHA», в то время как рост и потребление глицерина были лишь незначительно снижены (дополнительный рисунок S3).Фактически, титры SA в штамме UBR2 _CBS -L-G3P-SA- An DCT-02 были снижены до уровней, аналогичных тем, которые наблюдались в штамме UBR2 _CBS -DHA- An DCT- 02 (с «модулем DHA», но без «модуля SA», рис. 3), предполагая, что избыток цитозольного NADH, обеспечиваемый путем DHA, действительно имеет решающее значение для наблюдаемых высоких уровней SA в UBR2 _CBS -DHA-SA- Ан DCT-02.

Характеристика штамма

UBR2 _CBS -DHA-SA- An DCT-02 в биореакторах

Мы предположили, что повышенная доступность диоксида углерода в культуральной среде может способствовать метаболическому потоку через восстановительный путь SA.С этой целью штамм UBR2 _CBS -DHA-SA- An DCT-02 был охарактеризован в контролируемых условиях при периодическом культивировании в биореакторах и барботирован 10,3% диоксидом углерода со скоростью 500 мл / мин. В отличие от экспериментов со встряхиваемой колбой, сульфат аммония использовался в качестве источника азота; Контроль pH (при pH 5,0) позволяет избежать подкисления. Контролируемые условия культивирования привели к более высокой удельной скорости роста и конечной концентрации биомассы (Рисунок 4), чем во встряхиваемых колбах (Рисунок 3A), что могло быть связано с лучшей скоростью переноса кислорода, повышенной доступностью диоксида углерода и / или лучшим контролем pH в культура.Максимальный титр SA 10,3 г / л, достигнутый в экспериментах с биореактором (фиг. 4), был аналогичен титру, полученному при периодическом культивировании во встряхиваемой колбе. Полученный выход СК (0,16 ± 0,00 г / г) был на 28% ниже, чем в опытах со встряхиваемой колбой. Интересно, что пируват и лимонная кислота были обнаружены как дополнительные продукты только во время культивирования в биореакторе, но не во встряхиваемых колбах. Пируват накапливался через 55 ч (до 2 г / л), после чего титр снижался, а цитрат накапливался медленно в течение всего периода культивирования (до ~ 2 г / л).Расчет баланса твердого углерода через 71,5 ч (момент времени, когда был обнаружен самый высокий титр СК) показал, что 16,4% углерода из глицерина было обнаружено в СК, 1,4% в пирувате, 2,3% в цитрате, 43,2% в биомассе и 32,7%. % в образовавшейся двуокиси углерода, что эквивалентно 96% извлечения всего углерода.

Рисунок 4. Физиологическая характеристика штамма S. cerevisiae UBR2 _CBS -DHA-SA- An DCT-02 при периодическом культивировании в 2-литровых биореакторах с использованием синтетической среды, содержащей 75.6 г / л глицерина в качестве источника углерода и сульфата аммония в качестве источника азота (pH поддерживали на уровне 5,0 на протяжении всего культивирования). Показан один представитель из двух экспериментов.

Обсуждение

Производство высоких количеств СК из глюкозы в устойчивом продуцирующем хозяине S. cerevisiae является современным и даже уже коммерчески применяемым (Ahn et al., 2016). Целевой восстановительный путь очень привлекателен благодаря фиксации углекислого газа (Steiger et al., 2017). Как обсуждалось во введении, использование глицерина позволяет получить более высокий теоретический выход СК по сравнению с глюкозой. Первоначальная цель этого исследования состояла в том, чтобы установить окислительно-восстановительный путь для восстановительного производства СК из глицерина в одном из ранее созданных нами «штаммов пути DHA», катаболизирующих глицерин, из S. cerevisiae . Результаты демонстрируют, что можно производить значительные количества SA из глицеринсодержащей среды в экспериментах с встряхиваемыми колбами, как только штамм оснащен «модулем DHA», «модулем SA» и транспортером An DCT-02. .В экспериментах с биореакторами барботаж диоксида углерода, по-видимому, имеет решающее значение для получения значительного количества СК, поскольку пробные эксперименты без дополнительного количества диоксида углерода привели к значительно более низким титрам СК (данные не показаны). Возможное объяснение может заключаться в том, что карбоксилирование пирувата регулирует скорость и усиливается за счет более высокой концентрации диоксида углерода.

Один из основных вопросов, рассматриваемых в текущем исследовании, заключался в том, действительно ли СК продуцируется целевым окислительно-восстановительным путем или эндогенными путями, по крайней мере, способствует образованию продукта.В принципе, SA может также производиться путем обхода пируватдегидрогеназы с последующим циклом глиоксилата (рис. 2). Устранение потока через глиоксилатный цикл путем удаления ICL1 в штамме UBR2 _CBS -DHA-SA- An DCT-02 снизил максимальную концентрацию SA с 10,7 до 2,9 г / л. Это привело нас к предположению, что глиоксилатный цикл оказал важное влияние на выработку СК нашими сконструированными штаммами.

Тем не менее, установленный «модуль SA» должен также вносить значительный вклад в продукцию SA в штамме UBR2 _CBS -DHA-SA- An DCT-02, поскольку титр SA был намного выше (10.7 г / л) по сравнению с изогенным штаммом, который несет транспортер An DCT-02, но не имеет «модуля SA» (3,2 г / л). Рассматривая эти результаты плюс результаты, полученные с мутантом icl1 , мы предполагаем синергетический эффект между маршрутом обхода эндогенной пируватдегидрогеназы / глиоксилатного цикла и двумя последними ферментами «модуля SA» (рис. 2). Эту гипотезу еще предстоит подтвердить с помощью анализа метаболических потоков в будущем.

Интересно, что делеция ICL1 в штаммах UBR2 _CBS -DHA- An DCT-02 и UBR2 _CBS -DHA-SA- DCT-02 вызвала начало образования этанола. и немного улучшенное образование биомассы по сравнению с их соответствующими аналогами ICL1 дикого типа.Небольшое образование этанола также было видно в исходном штамме UBR2 _CBS -DHA. Мы предполагаем, что частичный переход к ферментации (который никогда не наблюдался у S. cerevisiae с использованием пути L-G3P) вызван повышенной скоростью генерации NADH (путь DHA) вместе с улучшенным поглощением глицерина (Aßkamp et al. , 2019). Уменьшение переноса кислорода во встряхиваемых колбах с объемом наполнения выше рекомендованных 10% также, по-видимому, способствовало производству этанола (Aßkamp et al., 2019). У нас также есть веские основания полагать, что фон генетического штамма оказывает сильное влияние на способность продуцирования этанола / ферментации штаммов S. cerevisiae пути DHA (неопубликованные результаты). Повышенная продукция этанола у мутантов icl1 может быть объяснена тем фактом, что цитозольный ацетил-КоА, возникающий в результате обхода пируватдегидрогеназы, не может войти в глиоксилатный цикл у мутантов с делецией icl1 . Это может вызвать перенаправление углерода от ацетальдегида к этанолу (рис. 2).Тот факт, что углерод предпочитает переходить в этанол, а не в СК (несмотря на лучший окислительно-восстановительный баланс в последнем сценарии), является еще одним признаком того, что карбоксилирование пирувата может регулировать скорость.

Улучшение образования биомассы, вызванное делецией ICL1 , вызывает недоумение, но может быть просто вызвано значительным снижением продукции СК в сочетании с уменьшенной диссипацией АТФ во время экспорта СК и, в конечном итоге, более высокой доступностью АТФ для процессов биосинтеза.Кроме того, цитозольный ацетил-КоА не может вступать в глиоксилатный цикл у мутантов с делецией icl1 . Уменьшение превращения ацетата в ацетил-КоА под действием ACS (АТФ-зависимая реакция) также приведет к более высокой доступности АТФ (рис. 2).

Как упоминалось во введении, ранее опубликованные исследования, направленные на продукцию SA с помощью S. cerevisiae через цитозольный восстановительный путь SA из глюкозы, включали повышенную активность пируваткарбоксилазы.Фактически, как Yan et al. (2014) и ван де Грааф и др. (2015, патент № US20150057425A1) для этой цели сверхэкспрессировали эндогенный ген PYC2 . Изначально мы не включали сверхэкспрессию пируваткарбоксилазы в сконструированные нами штаммы, поскольку несколько исследований показали значительно более высокий уровень экспрессии пируваткарбоксилазы в S. cerevisiae дикого типа, растущих на источниках углерода из дыхательных путей, по сравнению с глюкозой (DeRisi et al., 1997; Menéndez и Gancedo, 1998; Huet et al., 2000; Dueñas-Sánchez et al., 2012). Однако позже мы также сверхэкспрессировали PYC2 в штамме UBR2 _CBS -DHA-SA- An DCT-02 и неожиданно наблюдали значительное падение титра СК, сопровождающееся повышенным образованием этанола. Мы посвятили отдельное исследование, чтобы понять значительно измененные метаболические потоки, вызванные сверхэкспрессией PYC2 (Xiberras et al., Неопубликованные результаты).

Результаты, полученные с гиперэкспрессией PYC2 , демонстрируют наши пробелы в понимании центральных метаболических потоков при S.cerevisiae растет на глицерине, согласно недавнему обзору Xiberras et al. (2019). Одна из наших будущих целей — применение анализа метаболического потока ¹³ C к сконструированным штаммам.

Другой важной генетической модификацией продукции СК из глюкозы является отмена образования этанола, поскольку Yan et al. (2014) использовали PDC-отрицательный штамм в качестве исходного штамма (штамм ТАМ) (van Maris et al., 2004). Большинство сконструированных нами штаммов не производили значительных количеств этанола при выращивании в глицеринсодержащей синтетической среде, что сильно контрастировало с глюкозосодержащей синтетической средой.Фактически, штамм UBR2 _CBS -DHA-SA- An DCT-02 также был охарактеризован в синтетической среде, содержащей 75,6 г / л глюкозы. Как и ожидалось, штамм продуцировал относительно высокие количества этанола (максимум 30 г / л) из глюкозы, но практически не производил СК (данные не показаны). По-видимому, поток ацетальдегида в глиоксилатный цикл был достаточно сильным в среде, содержащей глицерин, чтобы большая часть углерода отвлекалась от производства этанола даже без какой-либо генетической модификации.Тем не менее, отмена глиоксилатного цикла привела к значительному образованию этанола. Следовательно, возможно, что дальнейшая инженерия штаммов требует предотвращения образования этанола.

Производство СК из глицерина и диоксида углерода по предусмотренному пути не только окислительно-восстановительно, но и нейтрально к АТФ (рис. 2). Однако следует учитывать, что экспортная энергетика имеет большое влияние на общий выход АТФ и максимальные титры продуктов. В частности, в случае слабых кислот это может привести к верхнему ограничению максимального теоретического выхода СК при микробной ферментации, особенно при низком pH и высоких титрах продукта.Несмотря на то, что это привлекательный подход для дальнейшего улучшения производства СК из глицерина и диоксида углерода, рациональная инженерия транспортной энергетики остается сложной задачей из-за недостаточных знаний об экспортерах органических кислот из S. cerevisiae (Бородина, 2019).

В целом, сконструированные здесь штаммы обеспечивают отправную точку для дальнейшей оптимизации конструкции штамма и условий процесса получения СК из глицерина в популярном производственном хозяине S.cerevisiae . Дальнейшая работа будет сосредоточена на дальнейшей метаболической инженерии, чтобы преодолеть контролирующие скорость этапы пути от оксалоацетата к SA, то есть направить углерод через первоначально предусмотренный окислительно-восстановительный путь. Одна проблема в инженерии штаммов, безусловно, возникает из-за потребности в АТФ, необходимом для транспорта метаболитов (как обсуждалось) и карбоксилирования пирувата. Фактически, нынешний дизайн штамма требует, чтобы часть глицерина вдыхалась и / или ферментировалась до этанола, чтобы обеспечить АТФ для образования СК, поддержания и роста клеток, что отрицательно сказывается на выходе СК.Будущие исследования могли бы сосредоточиться на этих энергетических потребностях, оценивая альтернативные транспортные системы и заменяя АТФ-зависимую пируваткарбоксилазу на АТФ-независимые пути.

Заявление о доступности данных

Наборы данных, проанализированные в этой статье, не являются общедоступными. Запросы на доступ к наборам данных следует направлять в EN, [email protected].

Авторские взносы

JX, MK и EN спланировали исследование и написали рукопись.JX сконструировал все штаммы и выполнил все культивирование во встряхиваемых колбах (периодическое культивирование). JX, EH и RM спланировали и провели эксперимент в биореакторе. EH и RM предоставили критическую обратную связь к рукописи.

Финансирование

Мы благодарим Немецкий исследовательский фонд (DFG) за финансирование нашего исследования (NE 697 / 7-1).

Конфликт интересов

Royal DSM N.V. предоставила нам плазмиды pGBS414PPK-3, pGBS415FUM-3 и pGBS416DCT-2, но не участвовала в дизайне исследования, сборе, анализе, интерпретации данных и написании статьи.

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Мы благодарим Royal DSM N.V. за любезно предоставленные плазмиды pGBS414PPK-3, pGBS415FUM-3 и pGBS416DCT-2, а также Селину Прош и Сольвейг Мароцке за техническую поддержку. Мы также благодарны Алрику Лос (Royal DSM N.V) и Джеку Пронку (TU Delft) за плодотворные обсуждения.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fbioe.2020.00566/full#supplementary-material

Список литературы

Ан, Дж. Х., Янг, Ю.-С., и Ли, С. Ю. (2016). Производство янтарной кислоты метаболически модифицированными микроорганизмами. Curr. Opin. Biotechnol. 42, 54–66. DOI: 10.1016 / j.copbio.2016.02.034

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Аскамп, М.Р., Кляйн, М., Невойгт, Э. (2019). Saccharomyces cerevisiae , демонстрирующий модифицированный путь поглощения и катаболизма глицерина, образует значительные количества этанола из этого источника углерода, который считается «неферментируемым». Biotechnol. Биотопливо 12: 257. DOI: 10.1186 / s13068-019-1597-2

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бопрез, Дж. Дж., Де Мей, М., и Соетарт, В. К. (2010). Микробиологическое производство янтарной кислоты: натуральные и метаболически модифицированные продуценты. Process Biochem. 45, 1103–1114. DOI: 10.1016 / j.procbio.2010.03.035

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бертани Г. (1951). Исследования по лизогенезу. I. Способ высвобождения фага лизогенными Escherichia coli . J. Bacteriol. 62, 293–300.

Google Scholar

Кломбург, Дж. М., и Гонсалес, Р. (2013). Анаэробная ферментация глицерина: платформа для возобновляемых видов топлива и химикатов. Trends Biotechnol. 31, 20–28. DOI: 10.1016 / j.tibtech.2012.10.006

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Коттон, К. А. Р., Клаассенс, Н. Дж., Бенито-Вакерисо, С., и Бар-Эвен, А. (2020). Возобновляемые метанол и формиат в качестве исходного сырья для микробов. Curr. Opin. Biotechnol. 62, 168–180. DOI: 10.1016 / j.copbio.2019.10.002

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

де Кок, С., Козак, Б. У., Пронк, Дж. Т., и ван Марис, А.Дж. А. (2012). Энергетическая связь в Saccharomyces cerevisiae : избранные возможности для метаболической инженерии. FEMS Yeast Res. 12, 387–397. DOI: 10.1111 / j.1567-1364.2012.00799.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

ДеРизи, Дж. Л., Айер, В. Р., и Браун, П. О. (1997). Изучение метаболического и генетического контроля экспрессии генов в геномном масштабе. Наука 278, 680–686. DOI: 10.1126 / science.278.5338.680

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дуэньяс-Санчес, Р., Гутьеррес, Г., Ринкон, А. М., Кодон, А. К., и Бенитес, Т. (2012). Транскрипционная регуляция ферментативного и респираторного метаболизма у штаммов промышленных пекарей Saccharomyces cerevisiae . FEMS Yeast Res. 12, 625–636. DOI: 10.1111 / j.1567-1364.2012.00813.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Дюсселье М., Маскаль М. и Сельс Б. Ф. (2014). «Лучшие химические возможности углеводной биомассы: взгляд химика на биоперерабатывающий завод», в книге Selective Catalysis for Renewable Feedstocks and Chemicals.Разделы современной химии , изд. К. Николас (Cham: Springer), 353.

Google Scholar

Флагфельдт Б. Д., Сиверс В., Хуанг Л. и Нильсен Дж. (2009). Характеристика сайтов хромосомной интеграции для экспрессии гетерологичных генов в Saccharomyces cerevisiae . Дрожжи 26, 545–551. DOI: 10.1002 / yea.1705

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гибсон, Д. Г., Янг, Л., Чуанг, Р.-Й., Вентер, Дж.К., Хатчисон, К. А. III., И Смит, Х. О. (2009). Ферментативная сборка молекул ДНК до нескольких сотен килобаз. Нат. Методы 6, 343–345. DOI: 10.1038 / nmeth.1318

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Гитц Р. Д., Шистл Р. Х., Виллемс А. Р. и Вудс Р. А. (1995). Исследования трансформации интактных дрожжевых клеток с помощью процедуры LiAc / SS-ДНК / PEG. Дрожжи 11, 355–360. DOI: 10.1002 / yea.320110408

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Геттлер, М.В., Румлер Д. и Джайн М. К. (1999). Actinobacillus succinogenes sp. nov., новый штамм, продуцирующий янтарную кислоту из рубца крупного рогатого скота. Внутр. J. Syst. Бактериол. 49 (Pt 1), 207–216. DOI: 10.1099 / 00207713-49-1-207

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Hakkaart, X., Liu, Y., Hulst, M., El Masoudi, A., Peuscher, E., Pronk, J., et al. (2020). Физиологические реакции Saccharomyces cerevisiae на промышленно значимые условия: медленный рост, низкий pH и высокий уровень CO2. Biotechnol. Bioeng. 117, 721–735. DOI: 10.1002 / бит. 27210

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хо, П.-В., Суиннен, С., Дуитама, Дж., И Невойгт, Э. (2017). Единственное введение двух одноточечных мутаций устанавливает утилизацию глицерина в производных Saccharomyces cerevisiae CEN.PK. Biotechnol. Биотопливо 10:10. DOI: 10.1186 / s13068-016-0696-6

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хоффман, К.С. и Уинстон Ф. (1987). Десятиминутный препарат ДНК из дрожжей эффективно высвобождает автономные плазмиды для трансформации Escherichia coli . Ген 57, 267–272. DOI: 10.1016 / 0378-1119 (87)

-4

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хуэт К., Менендес Дж., Ганседо К. и Франсуа Дж. М. (2000). Регулирование PYC1 , кодирующего изофермент I пируваткарбоксилазы, источниками азота в Saccharomyces cerevisiae . евро. J. Biochem. 267, 6817–6823. DOI: 10.1046 / j.1432-1033.2000.01779.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хаксли К., Грин Э. и Данэм И. (1990). Быстрая оценка типа спаривания S. cerevisiae с помощью ПЦР. Trends Genet. 6: 236. DOI: 10.1016 / 0168-9525 (90)-h

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Islam, Z.-U., Klein, M., Aßkamp, ​​M. R., Ødum, A. S. R., and Nevoigt, E. (2017). Модульный подход к метаболической инженерии для производства 1,2-пропандиола из глицерина с помощью Saccharomyces cerevisiae . Metab. Англ. 44, 223–235. DOI: 10.1016 / j.ymben.2017.10.002

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Янсен, М. Л. А., и ван Гулик, В. М. (2014). На пути к крупномасштабному ферментативному производству янтарной кислоты. Curr. Opin. Biotechnol. 30, 190–197. DOI: 10.1016 / j.copbio.2014.07.003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Янсен, М. Л., Хейнен, Дж. Дж., И Вервал, Р. (2017). Процесс получения дикарбоновых кислот с использованием грибковых клеток .Патент № US9624514B2.

Google Scholar

Джантама К., Чжан Х., Мур Дж. К., Шанмугам К. Т., Своронос С. А. и Инграм Л. О. (2008). Устранение побочных продуктов и увеличение выхода сукцината в сконструированных штаммах Escherichia coli . Biotechnol. Bioeng. 101, 881–893. DOI: 10.1002 / bit.22005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кляйн, М., Каррильо, М., Ксиберрас, Дж., Ислам, З., Суиннен, С., и Невойг, Э.(2016). На пути к использованию высокой восстанавливающей способности глицерина в биопроцессах на основе Saccharomyces cerevisiae . Metab. Англ. 38, 467–472.

Google Scholar

Ли П., Ли С., Хонг С. и Чанг Х. (2002). Выделение и характеристика новой бактерии-продуцента янтарной кислоты, Mannheimia succiniciproducens MBEL55E, из рубца крупного рогатого скота. Прил. Microbiol. Biotechnol. 58, 663–668. DOI: 10.1007 / s00253-002-0935-6

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Менендес, Дж.и Gancedo, C. (1998). Регуляторные области в промоторах генов Saccharomyces cerevisiae PYC1 и PYC2 , кодирующих изоферменты пируваткарбоксилазы. FEMS Microbiol. Lett. 164, 345–352. DOI: 10.1111 / j.1574-6968.1998.tb13108.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Наито, Ю., Хино, К., Боно, Х., и Уи-Тей, К. (2015). CRISPRdirect: программное обеспечение для создания управляющей РНК CRISPR / Cas с уменьшенным количеством нецелевых сайтов. Биоинформатика 31, 1120–1123. DOI: 10.1093 / биоинформатика / btu743

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Нейлор Р. Л. и Хиггинс М. М. (2017). Политическая экономия биодизеля в эпоху низких цен на нефть. Обновить. Поддерживать. Energy Rev. 77, 695–705. DOI: 10.1016 / j.rser.2017.04.026

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Окино, С., Нобурю, Р., Суда, М., Дзёдзима, Т., Инуи, М., и Юкава, Х. (2008).Эффективный процесс производства янтарной кислоты в метаболически модифицированном штамме Corynebacterium glutamicum . Прил. Microbiol. Biotechnol. 81, 459–464. DOI: 10.1007 / s00253-008-1668-y

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Пиназо, Дж. М., Домине, М. Э., Парвулеску, В., и Петру, Ф. (2015). Показатели устойчивости для производства янтарной кислоты: сравнение между основанными на биомассе и нефтехимическими маршрутами. Катализ сегодня 239, 17–24.DOI: 10.1016 / j.cattod.2014.05.035

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Postma, E., Verduyn, C., Scheffers, W. A., and van Dijken, J. P. (1989). Ферментный анализ эффекта крабтри в ограниченных по глюкозе культурах хемостата Saccharomyces cerevisiae . Прил. Environ. Microbiol. 55, 468–477. DOI: 10.1128 / aem.55.2.468-477.1989

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Рааб А.М., Гебхардт Г., Болотина Н., Вейстер-Ботц Д. и Ланг К. (2010). Метаболическая инженерия Saccharomyces cerevisiae для биотехнологического производства янтарной кислоты. Metab. Англ. 12, 518–525. DOI: 10.1016 / j.ymben.2010.08.005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Робертс Г., Хадсон А. П. (2006). Профилирование транскриптома Saccharomyces cerevisiae во время перехода от ферментативного к основанному на глицерине респираторному росту выявляет обширное метаболическое и структурное ремоделирование. Мол. Genet. Геномика 276, 170–186. DOI: 10.1007 / s00438-006-0133-9

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Шерман Ф. и Хикс Дж. (1991). Микроманипуляция и рассечение аски. Methods Enzymol. 194, 21–37. DOI: 10.1016 / 0076-6879 (91) 94005-w

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Swinnen, S., Ho, P.-W., Klein, M., and Nevoigt, E. (2016). Генетические детерминанты усиленного роста глицерина Saccharomyces cerevisiae . Metab. Англ. 36, 68–79. DOI: 10.1016 / j.ymben.2016.03.003

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

ван де Грааф, М. Дж., Валианпоер, Ф., Фие, Г., Делатр, Л., и Шультен, Э. А. М. (2015). Процесс кристаллизации янтарной кислоты . Патент № US20150057425A1.

Google Scholar

ван Марис, А. Дж. А., Гертман, Дж. А., Вермёлен, А., Гротуизен, М. К., Винклер, А. А., и Пайпер, М. Д. У. (2004). Направленная эволюция отрицательных по пируватдекарбоксилазе Saccharomyces cerevisiae , давая C2-независимые, толерантные к глюкозе и гиперпродуцирующие пируват дрожжи. Прил. Environ. Microbiol. 70, 159–166.

Google Scholar

Verduyn, C., Postma, E., Scheffers, W. A., and van Dijken, J. P. (1992). Влияние бензойной кислоты на метаболические потоки в дрожжах: исследование в непрерывном культивировании на регуляцию дыхания и алкогольного брожения. Дрожжи 8, 501–517. DOI: 10.1002 / yea.320080703

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Валь, С.А., Бернал Мартинес, К., Чжао, З., ван Гулик, В.М., и Янсен, М. (2017). Переработка внутриклеточного продукта с образованием дрожжей с высоким содержанием янтарной кислоты при низком pH. Microb. Cell Fact. 16:90. DOI: 10.1186 / s12934-017-0702-0

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Верпи, Т., и Петерсен, Г. (2004). Химикаты с наибольшей добавленной стоимостью из биомассы: Том I — Результаты скрининга потенциальных кандидатов из сахаров и синтез-газа. Голден, Колорадо: Национальная лаборатория возобновляемых источников энергии.

Google Scholar

Ксиберрас, Дж., Кляйн, М., Невойгт, Э. (2019). Глицерин в качестве субстрата для биопроцессов на основе Saccharomyces cerevisiae — Пробелы в знаниях о центральном катаболизме углерода этого «неферментируемого» источника углерода. Biotechnol. Adv. 37: 107378. DOI: 10.1016 / j.biotechadv.2019.03.017

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Xiberras, J., Klein, M., Prosch, C., Malubhoy, Z., and Nevoigt, E. (2020). Анаплеротические реакции, активные во время роста Saccharomyces cerevisiae на глицерине. FEMS Yeast Res. 1: foz086. DOI: 10.1093 / femsyr / foz086

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ян, Д., Ван, К., Чжоу, Дж., Лю, Ю., Ян, М., и Син, Дж. (2014). Построение восстановительного пути в Saccharomyces cerevisiae для эффективной ферментации янтарной кислоты при низком значении pH. Биоресурсы. Technol. 156, 232–239. DOI: 10.1016 / j.biortech.2014.01.053

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Повышенное производство янтарной кислоты в Mannheimia с использованием оптимальной малатдегидрогеназы

Штаммы и плазмиды

Штаммы, плазмиды и олигонуклеотиды, использованные в этом исследовании, перечислены в дополнительных таблицах 8, 9.Штаммы E. coli Top10 и E. coli W3110 использовали в качестве клонирующего хозяина для манипуляции генами и для продукции SA, соответственно. Штаммы E. coli культивировали при 37 ° C в среде лизогенного бульона (LB), содержащей (на литр) 10 г бакто триптона, 5 г дрожжевого экстракта и 10 г NaCl. Штамм C. glutamicum также использовали для продукции SA и культивировали при 30 ° C в среде BHIS, содержащей (на л) 37 г среды Bacto Brain Heart Infusion (BHI) и 91 г d-сорбита.Штаммы M. succiniciproducens культивировали при 39 ° C в среде BHI. Чашки LB и BHI готовили путем добавления 1,5% (мас. / Об.) Агара. При необходимости добавляли ампициллин (Ap), канамицин (Km) и хлорамфеникол (Cm) до конечных концентраций 50, 25 и 6,8 мкг / мл ^-1 соответственно для M. succiniciproducens и 50 мкг / мл. 25 и 24 мкг мл ^-1 соответственно для E. coli . В случае C. glutamicum к среде BHIS добавляли 25 мкг мл ^-1 Km.

Для конструирования pMS3-msmdh, pMS3-msmdh ^G11Q , pMS3-cgmdh, pMS3-cgmdh ^Q20G , pMS3-atmdhc1 и pMS3-atmdhm1, pMS3-atmdhm1, –230 msmdh2 msmdh2 msmdh2 msmdh2 msmdh2 G11Q (праймеры P1-2), cgmdh (праймеры P3-4), cgmdh ^Q20G (праймеры P3-4), atmdhc1 (праймеры P5-6) и atmdhm1 (праймеры 8) фрагменты генов получали с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с праймерами, перечисленными в дополнительных таблицах 8, 9, с использованием M.succiniciproducens геномная ДНК, pET30a — msmdh ^G11Q , C. glutamicum геномная ДНК, pET30a — cgmdh ^Q20G и A. thaliana в качестве геномной ДНК соответственно. Затем фрагменты каждого гена вставляли в pMS3, расщепленную Eco RI и Kpn I с использованием сборки Гибсона ⁴² . Для конструирования p10099A-cgmdh, p10099A расщепляли Eco RI и Pst I, и фрагмент гена cgmdh получали с помощью ПЦР с праймерами P18-19.Линеаризованный p10099A и фрагмент гена cgmdh были собраны с использованием сборки Гибсона. Для конструирования pEKEx1-cgmdh, pEKEx1 расщепляли Eco RI и Pst I, и фрагмент гена cgmdh получали с помощью ПЦР с праймерами P20-21. Линеаризованный pEKEx1 и фрагмент гена cgmdh были собраны с использованием сборки Гибсона. Правильное построение всех плазмид, разработанных в этом исследовании, было проверено с помощью секвенирования ДНК. Плазмиды pMS3-msmdh, pMS3-msmdh ^G11Q , pMS3-cgmdh, pMS3-cgmdh ^Q20G , pMS3-atmdhc1 и pMS3-atmdhm1 были трансформированы в штамм PALK ⁴³ .

Штамм PALKcgmdh M. succiniciproducens был сконструирован путем замены гена msmdh в геноме штамма PALK геном cgmdh . Для конструирования вектора интеграции гена cgmdh pINcgmdh плазмиду pSacHR06, содержащую ген sacB , расщепляли с помощью Xho, I и Sac I. Затем амплифицировали вышестоящие и нижележащие гомологичные области гена msmdh . геномная ДНК M. succiniciproducens PALK с праймерами P9-10 и P16-17 соответственно.Кассету lox66 — cat — lox77 амплифицировали из pMSmulox с праймерами P14-15, а ген cgmdh амплифицировали из pMS3-cgmdh с праймерами P11 и P13. Линеаризованные pSacHR06, фрагменты 1 т.п.н. вышележащих и нижележащих гомологичных областей гена msmdh , lox66 — cat — кассета lox77 и cgmdh фрагменты гена, наконец, были собраны с использованием сборки Gibson pgmdhINC, чтобы окончательно сконструировать фрагменты гена pgmin.Штамм M. succiniciproducens PALKmsmdh ^G11Q был сконструирован путем замены гена msmdh в штамме PALK на ген msmdh ^G11Q . Вектор интеграции гена msmdh ^G11Q pINmsmdh ^G11Q был сконструирован с использованием фрагментов ДНК, используемых для конструирования pINcgmdh, за исключением гена msmdh ^G11Q , который был амплифицирован с праймеров pMS3-G11Q с праймерами PMS3-G11-1290. Модель M.succiniciproducens Штамм PALKPfrdmsmdh был сконструирован путем замены промотора msmdh (P _mdh ) в штамме PALK на промотор frd (P _frd ). Для конструирования вектора интеграции последовательности P _frd pINPfrdmsmdh плазмиду pSacHR06, содержащую ген sacB , расщепляли с помощью Xho I и Sac I. Затем гомологичные области P 900h17 md выше и ниже Последовательность была амплифицирована из M.succiniciproducens геномная ДНК PALK с праймерами P22-23 и P24-25 соответственно. Кассету lox66 — cat — lox77 амплифицировали из pMSmulox с праймерами P26-27, а последовательность P _frd амплифицировали из pMS3 с праймерами P28-29. Линеаризованные pSacHR06, фрагменты 1 т.п.н. вышележащих и нижележащих гомологичных областей последовательности P _mdh , lox66 — cat — кассеты lox77 и P _frd фрагментов были собраны с использованием фрагментов последовательности Gibson. сборка, чтобы наконец построить pINPfrdmsmdh.Интеграции гетерологичных поколений в геном PALK проводили с использованием безмаркерной системы хромосомной интеграции ⁴³ .

Анализ in silico

Сканирование вариабельности потока на основе алгоритма принудительного объективного потока (FVSEOF) ⁴⁴ было выполнено с использованием модели метаболизма в масштабе генома M. succiniciproducens , которая состоит из 686 метаболических реакций и 519 метаболитов ³⁹ для идентификации амплификации гены-мишени для увеличения продукции СК в M.succiniciproducens (дополнительный рис. 1а). Алгоритм FVSEOF ищет изменения в пространстве раствора метаболического потока (т. Е. Минимальные и максимальные значения метаболического потока) внутриклеточной реакции в ответ на увеличенный поток к целевому химическому веществу. Основываясь на результатах FVSEOF, ферменты-кандидаты, которые обеспечили бы минимальную скорость продуцирования целевого химического вещества, были выбраны из наклона минимальных значений потока ( V _мин наклон), который был рассчитан с помощью линейной регрессии между принудительной скоростью продуцирования SA и минимальные значения потока ( В, _мин, ) внутриклеточных реакций (дополнительный рис.1б) ⁴⁵ . В качестве целевых ферментов были выбраны реакции, положительно связанные со скоростью продукции СК. На протяжении всего моделирования скорость поглощения глюкозы была установлена ​​на уровне 10 ммоль gDCW ^-1 ч ^-1 . Среди 686 метаболических реакций в модели M. succiniciproducens в масштабе генома, только четыре реакции показали увеличенные паттерны потока минимальных значений потока для продукции SA; FRD, PCKA, MDH и FUMC (дополнительная таблица 1).

Для сравнения количества NAD ⁺ / NADH, продуцируемого и потребляемого штаммом PALK при использовании одного (глюкоза) или двойного (глюкоза и глицерин) источников углерода, проведен анализ суммарного потока in silico всех 515 цитозольных метаболитов ⁴⁶ (дополнительный рис.13а). Сумма потоков — это сумма всех потоков, поступающих или исходящих от каждого метаболита. Цитозольные метаболиты учитывались только для анализа суммы потоков, чтобы сосредоточить внимание на метаболизме глюкозы / глицерина, происходящем внутри клетки. Экономичный анализ баланса потоков (pFBA) был выполнен для расчета распределений потоков, генерируемых при использовании одного или двух источников углерода, при максимальном производстве биомассы в качестве цели ⁴⁷ (дополнительный рисунок 13b). Гены ldhA , pta и ackA были удалены для имитации генотипа штамма PALK.Анализ изменчивости потока (FVA) ⁴⁸ был выполнен для расчета верхней и нижней границ потоков при максимальной скорости роста 95% с решением без петель ⁴⁹ . Чтобы верхняя и нижняя границы не были нереалистичными, было дано дополнительное ограничение, чтобы ограничить сумму всех абсолютных потоков в растворе FVA не более 10% от суммы всех абсолютных потоков в растворе pFBA. На протяжении всего моделирования, в котором глюкоза использовалась в качестве единственного источника углерода, скорость поглощения глюкозы была установлена ​​на уровне 10 ммоль gDCW ^-1 ч ^-1 .Для моделирования, в котором глюкоза и глицерин использовались в качестве двойных источников углерода, скорости поглощения глюкозы и глицерина были установлены на уровне 5 и 10 ммоль gDCW ^-1 ч ^-1 , соответственно. Скорости поглощения двойных источников углерода были установлены разными, чтобы уравнять количество атомов углерода (глюкоза, шесть атомов углерода; глицерин, три атома углерода), поступающих в метаболическую систему. Все симуляции проводились в среде Python с использованием Gurobi Optimizer 6.0 и пакета GurobiPy (Gurobi Optimization Inc., Хьюстон, Техас, США). Чтение, запись и изменение файлов SBML, совместимых с COBRA, были реализованы с помощью COBRApy ⁵⁰ .

Белковые препараты

Гены, кодирующие Ms, MDH (праймеры P30-31), As, MDH (праймеры P32-33), Cg, MDH (праймеры P34-35), Ec MDH (праймеры P36- 37), Yl MDH (праймеры P38-39), митохондриальный Sc MDh2 (праймеры P40-41), цитозольный Sc MDh3 (праймеры P42-43) и глиоксисомальный Sc MDh4 (праймеры P44-45) от м.succiniciproducens , A. succinogenes , C. glutamicum , E. coli , Y. lipolytica и S. cerevisiae были амплифицированы из их хромосомных ДНК с помощью ПЦР с праймерами, перечисленными в дополнительных таблицах 8, 9 дополнительных таблиц. Затем продукты ПЦР вставляли в pET30a (Novagen, Мэдисон, Висконсин, США) с 6 × His на С-конце. Полученные экспрессионные векторы трансформировали в штамм E. coli BL21 (DE3) ^T1R и выращивали в среде LB, содержащей 100 мг L ^-1 км при 37 ° C до OD ₆₀₀ (оптическая плотность при 600 нм) 0.6. После индукции 1,0 мМ 1-тио-β-d-галактопиранозид (IPTG) клетки дополнительно культивировали в течение 20 часов при 18 ° C и собирали центрифугированием при 5000 × g в течение 15 минут при 4 ° C. Осадок клеток ресуспендировали в 40 мМ Трис-HCl при pH 8,0 и разрушали ультразвуком. Клеточный дебрис удаляли центрифугированием при 11000 × g в течение 1 ч, и лизат связывали с колонкой с Ni-NTA агарозой (Qiagen, Chatsworth, CA, USA). После промывания 40 мМ трис-HCl, содержащим 20 мМ имидазол, при pH 8.0 белки, связанные со смолой, элюировали 300 мМ имидазолом в 40 мМ Трис-HCl при pH 8,0. Дальнейшую очистку проводили с использованием ионообменной хроматографии HiTrap Q и эксклюзионной хроматографии. Очищенные белки концентрировали до 30 г л ^-1 в 40 мМ трис-HCl при pH 8,0 для кристаллизации. Сайт-направленный мутагенез выполняли с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза QuikChange (Stratagene, La Jolla, CA, USA).

Анализ активности малатдегидрогеназы in vitro

Активность MDH измеряли с помощью спектрофотометра при 340 нм путем анализа остаточной концентрации NADH (коэффициент экстинкции 6.22 мМ ^-1 см ^-1 ) ⁵¹ . Относительные активности MDH по сравнению с активностью Ms MDH измеряли с использованием 0,5 мл реакционной смеси, содержащей 0,1 M трис-HCl при pH 7,0, 200 мкМ NADH, 100 мкМ оксалоацетата и 3 нМ различных MDH. Для измерения активности при различных значениях pH вместо 0,1 M трис-HCl использовали одну и ту же реакционную смесь, содержащую 0,1 М BIS-Tris или CHES-буфер для pH 5,0–6,0 и 9,0–10,0 соответственно. На основе нанесенных на график кинетических данных кинетические параметры были определены из анализа нелинейной регрессии на основе модифицированного уравнения Бриггса-Холдейна ^35,52 с использованием программного обеспечения OriginPro 2019 (OriginLab, Northampton, MA, USA).Все эксперименты проводили в трех экземплярах при комнатной температуре.

Анализ клеточного экстракта

Активность ферментов в клеточных экстрактах штаммов M. succiniciproducens PALK и PALKcgmdh измеряли с использованием спектрофотометра при 340 нм путем анализа остаточной концентрации NADH. Клеточный экстракт получали путем сбора клеток (OD ₆₀₀ из 50), выросших до поздней экспоненциальной фазы, с использованием центрифугирования при 5566 × g, и 4 ° C, дважды промывая клетки 0.1 М трис-HCl при pH 7,0 и обработка ультразвуком в конечном объеме 25 мл. Активность фермента в клеточном экстракте измеряли при pH 7,0 с использованием 0,5 мл реакционной смеси, содержащей 0,1 М трис-HCl, 200 мкМ NADH, 100 мкМ OAA и 10 мкл лизата клеточного экстракта. Концентрации общих белков в реакционных смесях, содержащих лизаты клеток PALK и PALKcgmdh, составляли 8,8 и 7,6 мкг / мл ^-1 соответственно.

Кристаллизация и определение структуры

Кристаллизация очищенных белков была первоначально выполнена с использованием следующих наборов для скрининга кристаллов: Index и PEG / Ion (Hampton Research) и Wizard I и II (Rigaku) ​​с использованием метода диффузии паров висячей капли в 20 ° С.Размер капли составлял 2 мкл, что включает 1 мкл раствора белка и 1 мкл резервуарного раствора, и капля уравновешивается 50 мкл резервуарного раствора. Кристаллы Ms MDH, совместно кристаллизованные с NAD ⁺ (молярное соотношение 1:10) для захвата продукта реакции внутри кристаллической структуры Ms MDH, появились в 16% (мас. / Об.) ПЭГ 3350 и 6%. (об. / об.) таксимат при pH 6,0. Раствор криопротектора представлял собой смесь 16% (мас. / Об.) ПЭГ 3350, 6% (об. / Об.) Таксима при pH 6,0 и 30% (об. / Об.) Глицерина.Данные были собраны при температуре 100 K на Beamline 7A ускорительной лаборатории Pohang (Pohang, Республика Корея) ⁵³ . Впоследствии данные были проиндексированы, интегрированы и масштабированы с использованием программного пакета HKL2000 ⁵⁴ . Кристаллы Ms MDH принадлежали к пространственной группе P6422 с параметрами элементарной ячейки a = 80,09 Å, b = 80,09 Å и c = 193,15 Å; α = β = 90 ° и γ = 120 °. Для одной молекулы Ms MDH на асимметричную единицу коэффициент Мэтьюза составил ~ 2.58 Å ³ Da ⁻¹ , что соответствует содержанию растворителя ~ 52,04% ⁵⁵ . Структура MDH Ms была определена путем молекулярной замены версией CCP4 MOLREP ⁵⁶ с использованием структуры MDH из Haemophilus influenza e (код PDB 6BAL, 77% идентичности последовательностей) в качестве модели поиска. Построение модели выполнялось с помощью программы WinCoot ⁵⁷ , а уточнение выполнялось с помощью REFMAC5 ⁵⁸ . Кристаллы MDH Cg высочайшего качества, совместно кристаллизованные с 1-малатом и NAD ⁺ (молярное соотношение 1:20 и 1:10), появились в 20% (мас. / Об.) PEG 3350,0.1 M HEPES при pH 7,5 и 0,2 M MgCl ₂ · 6H ₂ O. Раствор криопротектора включает 20% (мас. / Об.) PEG 3350, 0,1 M HEPES при pH 7,5, 0,2 M MgCl ₂ · 6H ₂ O и 30% (об. / Об.) Глицерина. Кристаллы Cg MDH принадлежали к пространственной группе C2 с параметрами элементарной ячейки a = 102,93 Å, b = 116,94 Å и c = 66,00 Å; α = γ = 90 ° и β = 95,31 °. Используя одну молекулу Cg MDH на асимметричную единицу, коэффициент Мэтьюза составил ~ 2.87 Å ³ Da ⁻¹ , что соответствует содержанию растворителя ~ 56,77% ⁵⁵ . Структуру MDH Cg определяли путем молекулярного замещения версией MOLREP CCP4 с использованием структуры MDH из Mycobacterium tuberculosis (код PDB 4TVO, идентичность последовательности 57%) в качестве модели поиска. Модель была построена в соответствии с описанной выше процедурой. Статистический анализ данных обобщен в дополнительной таблице 6. Уточненные модели Ms MDH и Cg MDH были депонированы в банке данных по белкам с кодами PDB 6ITL (https: // doi.org / 10.2210 / pdb6ITL / pdb) и 6ITK (https://doi.org/10.2210/pdb6ITK/pdb) соответственно.

Максимальная вероятность филогенетического дерева

Итерационный поиск MDH-подобных белков был выполнен с помощью инструмента Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) на сервере Национального центра биотехнологической информации с использованием позиционно-зависимого итеративного метода BLAST ⁵⁹ . Выравнивание множественных последовательностей выполняли с помощью Clustal omega ⁶⁰ . История эволюции была выведена с использованием метода максимального правдоподобия на основе модели Le_Gascuel_2008 ⁶¹ .Исходные деревья для эвристического поиска были получены автоматически путем применения алгоритмов Neighbor-Join и BioNJ к матрице попарных расстояний, оцененных с использованием модели JTT, а затем выбора топологии с превосходным значением логарифмического правдоподобия. Дискретное гамма-распределение использовалось для моделирования различий в скорости эволюции между сайтами (5 категорий, параметр = 1,0385). Модель вариации скорости позволила 1,33% сайтов оставаться эволюционно неизменными. Дерево с наибольшим логарифмическим правдоподобием (-58574,72) показано на дополнительном рис.2. Филогенетическое дерево построено в масштабе с длинами ветвей, измеренными числом замен на сайт. В анализе задействованы 343 аминокислотные последовательности. Все позиции с охватом сайта менее 95% были исключены. То есть в любой позиции допускались менее 5% -ные пробелы в выравнивании, недостающие данные и неоднозначные основания. В окончательном наборе данных было всего 263 позиции. Эволюционный анализ проводился с использованием MEGA X ⁶² .

Производство

SA с использованием

C. glutamicum и E.coli

Штаммы дикого типа и сконструированные штаммы C. glutamicum культивировали в аэробных условиях в колбе Эрленмейера, снабженной отверстиями для впуска и выпуска газа CO ₂ . Каждая колба содержала 100 мл среды BHIS. Аэробное культивирование проводили в течение 6 ч при 30 ° C со встряхиванием, поскольку штаммы C. glutamicum не могут расти в анаэробных условиях ⁷ . Затем в каждую колбу добавляли IPTG до конечной концентрации 0,5 мМ, чтобы инициировать экспрессию Cg MDH.Наконец, в колбы загружали CO ₂ в качестве газа над паром и инкубировали при 30 ° C при встряхивании в течение 10 часов. Штаммы E. coli дикого типа и сконструированные штаммы были анаэробно культивированы в течение 16 часов в 100 мл среды LB с 3 г глюкозы L ^-1 при 37 ° C со встряхиванием. Начальные концентрации клеток дикого типа и сконструированных штаммов C. glutamicum и E. coli составляли OD ₆₀₀ 0,2–0,25.

Ферментация и аналитические процедуры

Модель M.succiniciproducens штамм предварительно культивировали в пробирке на 50 мл или в колбе Эрленмейера на 500 мл, снабженной впускным и выпускным отверстиями для газа CO ₂ . Каждая пробирка и колба содержали 20 и 270 мл, соответственно, сложной среды MH5 (на 1 л: 2,78 г дрожжевого экстракта, 2,78 г полипептона, 0,18 г NaCl, 0,02 г CaCl ₂ · 2H ₂ O, 0,2 г MgCl ₂ · 6H ₂ O и 8,06 г K ₂ HPO ₄ и 9,15 г NaHCO ₃ ). После доведения pH сложной среды до 7.0 с использованием 5 M NaOH и промывки CO ₂ , стерилизовали нагреванием при 121 ° C в течение 15 минут. Источники углерода (глюкоза и глицерин) стерилизовали отдельно и добавляли в культуральную среду до конечной концентрации 10 г л ^-1 . Затем 2,5 мл исходной культуры глицерина (15%, мас. / Об.), Которая хранилась в морозильной камере при -70 ° C, инокулировали в 50-миллилитровую пробирку, содержащую сложную среду и источник углерода. Пробирку, заполненную CO ₂ в качестве газа свободного пространства над паром, инкубировали в статическом инкубаторе при 39 ° C.Затем 5% (об. / Об.) Культивируемого клеточного бульона переносили в колбу Эрленмейера на 500 мл, содержащую комплексную среду и источник углерода, для дальнейшего культивирования в тех же условиях, что и для культивирования в пробирке.

Периодические ферментации с подпиткой проводили в биореакторе Bioflo 3000 объемом 6,6 л (New Brunswick Scientific Co., Эдисон, Нью-Джерси, США) с рабочим объемом 2,5 л. CDM, использованный в этом исследовании, содержал (на литр) 1 г NaCl, 0,02 г CaCl ₂ · 2H ₂ O, 2 г (NH ₄ ) ₂ SO ₄ , 0.5 г аланина, 0,5 г аспарагина, 0,005 г биотина, 0,5 г метионина, 0,005 г пантотената кальция, 0,005 г пиридоксина-HCl, 0,005 г тиамина, 0,2 г MgCl ₂ · 6H ₂ O, 1,5 г K ₂ HPO ₄ , 9,997 г NaHCO ₃ , 0,005 г аскорбиновой кислоты, 0,5 г аспарагиновой кислоты, 0,5 г цистеина, 0,005 г никотиновой кислоты, 0,5 г пролина, 0,5 г серина и 5 мл раствора следов металлов. Раствор микроэлементов содержал (на 1 л) 5 мл HCl, 10 г FeSO ₄ · 7H ₂ O, 2,25 г ZnSO ₄ · 7H ₂ O, 1 г CuSO ₄ · 5H ₂ О, 0.5 г MnSO ₄ · 5H ₂ O, 0,23 г Na ₂ B ₄ O ₇ · 10H ₂ O и 0,1 г (NH ₄ ) ₆ Mo ₇ О ₂₄ . В CDM добавляли 18,02 г L ^-1 (100 мМ) глюкозы и / или 4,60 г L ^-1 (50 мМ) глицерина. При необходимости добавляли антибиотики до следующей концентрации: Ap (50 мг L ^-1 ) и Km (25 мг L ^-1 ). Раствор для кормления состоял из 900 г л ^-1 глюкозы и / или глицерина.Периодическая ферментация с подпиткой была инициирована инокуляцией 300 мл предварительно культивированного бульона, что дало начальную OD ₆₀₀ 0,2–0,3. Температуру и скорость перемешивания четырех крыльчаток турбины с плоскими лопастями в биореакторе контролировали при 39 ° C и 200 об / мин, соответственно. PH ферментационного бульона контролировали на уровне 6,5 путем автоматического добавления смеси 1,57 М раствора аммиака и 6,84 М раствора MgOH ₂ . Биореактор непрерывно барботировали промышленным газом CO ₂ при скорости потока 0 ° C.2 об / мин (объем CO ₂ на рабочий объем в минуту) с помощью регулятора массового расхода. Ферментации с подпиткой выполняли в полунепрерывном режиме подачи, при котором питательный раствор подавался в биореактор через перистальтический насос, чтобы поддерживать концентрацию источника углерода на уровне 5-15 г л ^-1 для минимизации ингибирования субстрата путем изменения скорость подачи. Для периодической ферментации с подпиткой с более высоким содержанием инокулята клетки собирали из периодической ферментации объемом 10 л и ресуспендировали с использованием 200 мл CDM.Остальные процедуры ферментации были идентичны обычной периодической ферментации с подпиткой, за исключением исходных концентраций глюкозы и глицерина, которые составляли 36,4 и 9,2 г л ^-1 , соответственно.

Концентрации глюкозы, глицерина и ферментативных продуктов немедленно контролировались с помощью ВЭЖХ ProStar 210 (Varian, Калифорния, США) в сочетании с ProStar 320 в УФ / видимом свете (Varian) и индексом преломления Shodex RI-71 (Shodex, Токио, США). Япония) детекторы за весь период брожения.Колонку MetaCarb 87 H (300 × 7,8 мм; Agilent, CA, USA) элюировали изократически (скорость потока = 0,6 мл мин ^-1 ) с использованием 0,01 н. H ₂ SO ₄ при 60 ° C. Рост клеток контролировали путем измерения OD ₆₀₀ с использованием спектрофотометра Ultrospec 3000 (GE Healthcare, Chalfont St. Giles, UK). Оптическую плотность переводили в концентрацию клеток, определяемую как грамм сухого веса клеток (gDCW), с использованием заранее определенной стандартной кривой (1 OD ₆₀₀ = 0,451 гDCW L ^-1 ).При совместном использовании глюкозы и глицерина выход СК рассчитывали на основе эквивалента глюкозы (моль СК на моль эквивалента глюкозы) для четкого сравнения. Поскольку количество атомов углерода в глюкозе и глицерине различается в 2 раза, количество потребленного глицерина (моль) было преобразовано в моль глюкозного эквивалента для расчета общего количества источников углерода, потребленных в ходе периодической ферментации с подпиткой.

Измерение внутриклеточного pH

Внутриклеточного pH M.Штаммы succiniciproducens PALK, PALKcgmdh и PALKmsmdh ^G11Q определяли с использованием набора pHrodo ^TM Green AM для внутриклеточного pH-индикатора (номер по каталогу P35373, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Клетки собирали в поздней экспоненциальной фазе с использованием центрифугирования при 5566 × g, и 4 ° C. Затем клетки промывали раствором для визуализации живых клеток (Invitrogen) для удаления культуральной среды. Затем клетки ресуспендировали в окрашивающем растворе pHrodo ^TM AM, содержащем pH-чувствительные флуорогенные зонды, которые проявляют возрастающую флуоресценцию при снижении pH, и инкубировали при 37 ° C в течение 30 минут.PH-чувствительный флуорогенный зонд был модифицирован ацетоксиметиловым эфиром, что позволило зонду легко проникать через клеточную мембрану и удерживаться во внутриклеточном пространстве ⁶³ . Наконец, интенсивность флуоресценции зонда внутри клеток измеряли с использованием многомодового микропланшетного ридера Spark ^® (Tecan, Männedorf, Швейцария) при возбуждении / испускании 509/533 нм. Калибровочная кривая, которая показывает интенсивность флуоресценции, испускаемой флуорогенным зондом внутри клеток, когда внутриклеточный pH находится в диапазоне от 4.5-7,5, был получен с использованием набора буфера для калибровки внутриклеточного pH (№ по каталогу P35379, Invitrogen) и использовался для количественного определения внутриклеточного pH штаммов M. succiniciproducens PALK, PALKcgmdh и PALKmsmdh ^G11Q .

Измерение внутриклеточной концентрации OAA

Перед анализом внутриклеточной концентрации OAA, внутриклеточные метаболиты были извлечены из штамма M. succiniciproducens PALK с использованием модифицированной версии протокола тушения / экстракции, описанного в предыдущем исследовании ⁶⁴ .Вкратце, клетки культивировали до поздней экспоненциальной фазы и 60 мл культурального бульона смешивали с 180 мл ледяного гасящего раствора (60% об. / Об. Водный метанол). Смесь немедленно центрифугировали при 5566 × g и 0 ° C в течение 10 мин для удаления супернатанта. Затем осадок клеток обрабатывали жидким азотом и сушили вымораживанием. Экстракцию внутриклеточных метаболитов проводили обработкой высушенных клеток 0,8 мл холодной 1 М хлорной кислоты. Затем обработанные клетки центрифугировали при 15871 × g и 0 ° C в течение 15 мин для сбора супернатанта.Клеточный дебрис ресуспендировали с использованием деионизированной воды и фильтровали с использованием предварительно взвешенного мембранного фильтра 0,2 мкм (Whatman International Ltd., Кент, Великобритания). Отфильтрованный мембранный фильтр полностью сушили в сушильном шкафу при 70 ° C и взвешивали. Затем определяли gDCW анализируемого образца путем вычитания веса мембранного фильтра из общего веса. Наконец, супернатант, содержащий внутриклеточные метаболиты, нейтрализовали с использованием 0,4 мл холодного 3 М KHCO ₃ и центрифугировали при 15871 × g и 0 ° C в течение 15 минут для удаления осадка.

Количество внутриклеточного OAA в супернатанте определяли количественно с использованием набора для анализа OAA (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США). Изначально бесцветный зонд в реакционной смеси превращается в сильно окрашенный и флуоресцентный продукт после воздействия пирувата, который превращается из OAA (одного из метаболитов в супернатанте) с помощью ферментной смеси. Реакционная смесь содержала 2 мкл ферментной смеси, 2 мкл проявителя, 2 мкл зонда OAA и 44 мкл супернатанта, который был предварительно разбавлен (1: 1) с использованием аналитического буфера для регулировки флуоресценции для правильного расчета OAA с использованием кривой метод подгонки.Буфер для анализа, смесь ферментов, проявитель и зонд OAA были предоставлены в наборе для анализа OAA. Интенсивность флуоресценции зонда измеряли с помощью многомодового микропланшетного ридера Spark ^® при возбуждении / испускании 535/587 нм. Поскольку внутриклеточный пируват уже существует в штамме M. succiniciproducens PALK, интенсивность флуоресценции зонда из реакционной смеси, не содержащей смеси ферментов (контроль), также была проанализирована для определения фоновой флуоресценции. Фоновую флуоресценцию вычитали из интенсивности флуоресценции зонда из реакционной смеси, содержащей смесь ферментов.Калибровочная кривая, показывающая интенсивность флуоресценции, испускаемой зондом, когда количество OAA варьировалось от 0 до 1,0 моль, также была построена и использована для количественного определения количества внутриклеточного OAA в анализируемом образце. Наконец, были измерены объем и сухая масса отдельной клетки штамма M. succiniciproducens PALK (описано ниже) и использованы для расчета внутриклеточной концентрации OAA в отдельной клетке.

Измерение объема отдельной ячейки и сухой массы

Измерение объема отдельной ячейки и сухой массы М.succiniciproducens штамм PALK были проанализированы с использованием трехмерной количественной фазовой визуализации (QPI) и количественного анализа изображений. 3D QPI живых клеток (культивированных до поздней экспоненциальной фазы) выполняли с использованием коммерческой голотомографии HT-2H (Tomocube Inc., Тэджон, Республика Корея), которая основана на интерферометрии Маха-Цендера, оснащенной устройством цифрового микрозеркала ( DMD). Когерентный монохроматический лазер ( λ, = 532 нм) был разделен на два пути, опорный луч и образец луча, с помощью одномодового волоконного соединителя 2 × 2.Трехмерная томограмма показателя преломления (RI) была восстановлена ​​из нескольких двумерных голографических изображений, полученных при 49 условиях освещения, нормальном падении и 48 азимутально-симметричных направлениях с полярным углом (64,5 °). DMD использовался для управления углом падения луча освещения на образец ⁶⁵ . Дифрагированные пучки от образца собирались с помощью объектива с высокой числовой апертурой (NA = 1,2) UPLSAP 60XW (Olympus, Токио, Япония). Внеосевая голограмма записывалась датчиком изображения CMOS FL3-U3-13Y3MC (FLIR Systems, Wilsonville, Oregon, USA).Визуализация 3D-карт RI была выполнена с использованием программного обеспечения TomoStudio ^TM (Tomocube Inc.). Подробную информацию о принципе оптической дифракционной томографии и восстановленном коде MATLAB можно найти в другом месте ^66,67,68,69 . Каждая ячейка, обнаруженная с помощью 3D QPI, была сегментирована с использованием пороговых значений RI, определенных методом Оцу, и сегментации водораздела, контролируемой маркером. Объем одной клетки штамма M. succiniciproducens PALK был рассчитан на основе физического размера отдельных вокселей.Сухую массу отдельных клеток штамма M. succiniciproducens PALK рассчитывали с использованием 0,19 мл г ^-1 в качестве приращения показателя преломления ^70,71 .

Сводка отчетов

Дополнительная информация о дизайне исследований доступна в Сводке отчетов по исследованиям природы, связанной с этой статьей.

Соя как источник ценного химического вещества

Ученые Университета Райса превращают малоценное соевое сусло в высокоценную янтарную кислоту

Скромная соя может стать новым недорогим источником широко используемого химического вещества для пластмасс, текстиля, лекарств, растворителей и в качестве пищевой добавки.

Неперевариваемые побочные продукты соевых бобов можно превратить в ценную янтарную кислоту с помощью процесса, разработанного в Университете Райса.

Янтарная кислота, традиционно получаемая из нефти, является одним из основных направлений исследований химиков-рисовальщиков Джорджа Беннета и Ка-Ю Сан. В 2004 году Министерство энергетики назвало янтарную кислоту одним из 12 «платформенных» химикатов, которые могут быть произведены из сахаров биологическим путем и превращены в ценные материалы.

Несколько лет назад Райс запатентовал способ производства янтарной кислоты на биологической основе, разработанный Беннетом и Саном, в котором использовались генетически модифицированные E.coli для преобразования глюкозы в янтарную кислоту способом, который будет конкурировать с производством на основе нефти.

Новый процесс получения сукцината, разработанный Беннеттом, Саном и Чандрешем Таккером и недавно опубликованный в Bioresource Technology, обещает еще более эффективно использовать дешевое и доступное сырье, в первую очередь неперевариваемые части сои.

«Мы пытаемся найти более дешевое возобновляемое сырье для начала, чтобы конечный продукт был более прибыльным», — сказал Таккер, научный сотрудник лаборатории Беннета в Rice’s BioScience Research Collaborative и ведущий автор исследования.«Задача заключалась в том, чтобы сделать этот процесс производства биомассы конкурентоспособным по стоимости с нефтехимическими методами, которые люди использовали в течение многих лет».

Bennett считает, что они сделали это с сырьем, полученным из соевых бобов, в качестве недорогого источника углерода, который микроорганизмы переваривают для производства желаемого химического вещества путем ферментации. «Многие люди используют для приготовления пищи растительные масла — кукурузное, соевое или рапсовое — вместо сала, как это делали в старые времена», — сказал он. «Масла являются одними из основных продуктов этих семян.Другой продукт — белок, который используется в качестве высококачественной пищи.

Команда химиков из Университета Райса модифицирует бактерии E. coli, чтобы производить ценную янтарную кислоту из побочных продуктов соевых бобов. Слева направо: профессор Джордж Беннет, ученый-исследователь Чандреш Таккер и профессор Ка-Ю Сан.

«Остается неперевариваемая клетчатка и небольшие углеводы», — сказал Беннет, профессор биохимии и клеточной биологии компании Rice’s E. Dell Butcher. «Он используется в небольших количествах в некоторых кормах для животных, но в целом это очень малоценный материал.”

Исследователи риса изменяют это с помощью бактерий E. coli , созданных для обработки соевого шрота, от которого обычно отказываются. Некоторые микробы естественным образом производят янтарную кислоту из такого сырья, но манипулирование метаболическими путями E. coli (например, путем устранения путей, производящих другие химические вещества, такие как этанол) может сделать его гораздо более эффективным.

Развивая успехи в производстве янтарной кислоты из глюкозы, новые микробы сконструированы для метаболизма различных сахаров, содержащихся в соевом шроте.Теоретический идеал — это соотношение сырья (экстрагированных сахаров) к продукту 1: 1, что, по их мнению, достижимо в промышленности. В лаборатории, в менее контролируемых условиях, они все же обнаружили, что процесс очень эффективен. «Мы демонстрируем очень высокую урожайность», — сказал Таккер. «Мы достигаем в колбе неоптимизированного образования сукцината, что близко к теоретической цели».

Беннет сказал, что его лаборатория изучает соевые бобы почти три года. «Мы всегда заинтересованы в дешевом сырье», — сказал он.«Нам удалось установить связь с группой производителей сои, которая очень заинтересована в технологиях, позволяющих более эффективно и с большей прибылью использовать свой урожай.

«Доступно изрядное количество остатков масличных семян, включая углеводы из семян хлопка, которые не используются для производства каких-либо дорогостоящих продуктов, и мы находимся в области микробной инженерии, чтобы обеспечить эффективное использование материалов такого рода, » он сказал.